L'ONCOGENE NOTCH1 REGOLA L'ESPRESSIONE DI RECETTORI CHEMOCHINICI NELLA LEUCEMIA ACUTA: CARATTERIZZAZIONE DEL MECCANISMO MOLECOLARE
Progetto Notch1 ha un ruolo oncogenico in diversi contesti cellulari, quello più studiato è la leucemia linfoblastica acuta a cellule (T-ALL). Le mutazioni di Notch1 complessivamente colpiscono circa il 60% dei pazienti con T-ALL. Forme oncogeniche di Notch1 inducono T-ALL in topi transgenici. I meccanismi alla base di questo effetto non sono completamente noti e coinvolgono tra l'altro la regolazione di geni anti-apoptotici (Bcl-2, FLIP, IAP-2, p53, etc.) e di geni deputati alla transizione dalla fase G0/G1 alla fase S del ciclo cellulare (c-Myc, Cicline e Chinasi Ciclino-dipendenti).
Un precedente finanziamento FIRST ha contribuito a identificare fra le funzioni di Notch: la capacità di alterare la capacità migratoria di linee celluari di T-ALL incrementando la trascrizione dei geni per alcuni recettori chemochinici (CR): CCR5, CCR8 e CCR9.
Questi risultati, in fase di pubblicazione, suggeriscono la possibilità che Notch influenzi la localizzazione leucemica sito specifica e la crescita tumorale limitando, anche attraverso la segnalazione dei CR, la sensibilità all'apoptosi dei blasti leucemici e favorendone la proliferazione.
Intendiamo qui approfondire i meccanismi molecolari con cui Notch regola la trascrizione dei CR.
Piano della ricerca:
1)Valutare l'effetto di Notch1 sui promotori dei CR mediante Dual luciferase Reporter Assay. Tali saggi saranno effettuati su cellule Jurkat co-transfettate con il plasmide pGL3 (che porterà i promotori dei CR in esame a monte del gene per la luciferasi), e con il plasmide normalizzatore pRL-TK.
Per valutare l'effetto di Notch su tali promotori, questo verrà overespresso co-transfettando pCDNA3-NotchDE (overesprimente la forma costitutivamente attiva) o inibito mediante inibitori della gamma-Secretasi. La forza dei promotori analizzati sarà paragonata alla sequenza promotrice canonica transattivata da Notch presente nel plasmide p13xRBPJK.
2)Al fine di valutare se l'effetto di Notch sia diretto o mediato da effettori neosintetizzati si effettueranno i saggi reporter con pCDNA3-NotchDE in presenza di un inibitore della sintesi proteica (i.e.Cicloesimmide).
3)Si ricercheranno possibili effettori Notch-dipendenti in grado di mediare l'effetto di attivazione della trascrizione Notch-dipendente. I pathway analizzati saranno quelli del target trascrizionale di Notch, c-Myc, e quello di Lck, tirosin-chinasi della famiglia Src, attivata mediante interazione diretta con Notch1. Inizialmente si valuterà un possibile ruolo di c-Myc e Lck mediante trattamento con inibitori specifici che mirerà a valutare se: a) tali inibitori abbiano lo stesso effetto di inibizione della trascrizione dei CR ottenuta somministrando inibitori delle gamma-Secretasi. Si analizzeranno variazioni di espressione genica (RT-PCR) e capacità migratoria specifica (saggi di chemotassi); b) gli inibitori siano in grado di antagonizzare la capacità di pCDNA3-NotchDE di transattivare i promotori dei CR.