STUDIO DELLE SEQUENZE RIPETUTE LINEs COME STAZIONI DI ANCORAGGIO DELL'RNA DI XIST AL CROMOSOMA X INATTIVO
Progetto Recentemente, è stato dimostrato che il cromosoma X inattivo (Xi) è costituito da due differenti tipi di eterocromatina; si possono infatti distinguere regioni ricche in macro istone H2A (mH2A) e in metilazione della lisina 27 dell'istone H3 (H3mK27) a cui si lega l'RNA di XIST, alternate a regioni ricche in metilazione della lisina 9 dell'H3 (H3mK9) e metilazione della lisina 20 dell'H4 (H4mK20) a cui si lega l'Heterochromatin Protein 1 (HP1). In immunofluorescenza, il dominio nucleare dell'Xi risulta diviso in due regioni eterocromatiche adiacenti, la tipo 1 positiva a mH2A, H3mK27 e XIST, e la tipo 2 positiva a H3mK9, H4mK20 e HP1. Mentre è noto che HP1 si lega direttamente all'H3mK9, non si conosce ancora, il bersaglio dell'RNA di XIST. Il sequenziamento del cromosoma X, ha evidenziato che esso è particolarmente ricco in sequenze ripetute rispetto agli autosomi, in particolare di long interspersed nuclear elements (LINEs). Recentemente è stato ipotizzato che queste sequenze possano essere gli "elementi di ancoraggio" di XIST al cromosoma Xi. La maggior concentrazione di LINEs si osserva, infatti, nelle regioni dell'X ricche di geni soggetti all'inattivazione. Per verificare questa ipotesi ci siamo proposti di analizzare:
-il contenuto di LINEs nei due tipi di eterocromatina che caratterizzano il cromosoma Xi, per valutare se ci sia un arricchimento di LINEs nelle regioni di tipo 1, dove si lega l'RNA di XIST, rispetto alle regioni di tipo 2. (Questa parte del progetto è già in corso, ma i risultati sono ancora preliminari);
-lo stato di metilazione del DNA delle LINEs, nei due tipi di eterocromatina, per valutare se questa modificazione epigenetica, possa essere discriminante per il legame con XIST. Lo stato di metilazione del DNA, infatti, è risultato essere correlato con lo stato di attivazione di queste sequenze ripetute.
METODI: Verranno utilizzate tre linee cellulari di ibrido uomo-hamster che hanno mantenuto, come unico cromosoma umano, l'X attivo (Xa) (Y.162.11C) o l'X inattivo (Y.162.5E1T2 e HY.70C4T3). Le due tipologie di eterocromatina verranno isolate mediante immunoprecipitazione della cromatina con anticorpi diretti contro:
-H3mK27 e mH2A (tipo 1);
-H3mK9 e H4mK20 (tipo 2).
Sulle varie frazioni di immunoprecipitato sarà effettuata:
-una determinazione quantitativa delle LINEs mediante real-time PCR;
-una valutazione dello stato di metilazione delle LINEs mediante Pyrosequencing, metodica che permette la quantificazione della metilazione di ogni citosina della sequenza, dopo modificazione del DNA con bisolfito di sodio. Queste analisi ci permetteranno di stabilire se, nelle frazioni ottenute con gli anticorpi per l'eterocromatina di tipo 1 dagli ibridi con solo l'Xi, sia presente un arricchimento o uno stato di metilazione particolare delle LINEs, rispetto alle frazioni ottenute con gli altri anticorpi. L'ibrido con l'Xa, verrà utilizzato come controllo negativo, in quanto non sono presenti le modificazioni in studio.