IDENTIFICAZIONE DELL'AGONISTA DEL RECETTORE DELLA PROTEINA C SULLE CELLULE TUMORALI IN VITRO.
Progetto Premessa. Il recettore endoteliale della proteina C (EPCR) partecipa alla attivazione della proteasi serinica proteina C, che mantiene la natura anti-trombotica dell'endotelio e media l'attività anti-apoptotica esercitata dalla proteina C attivata (APC). EPCR è stato anche identificato in cellule extravascolari, in linee tumorali e nel 50% di tumori mammari umani non metastatizzati . In uno studio che abbiamo appena concluso, abbiamo analizzato, mediante silenziamento del gene di EPCR tramite DNA interference, il ruolo di EPCR nella linea MDA-MB-231 di carcinoma mammario. APC a concentrazioni fisiologiche determina una riduzione dell'apoptosi del 30% in modo EPCR dipendente. Le MDA-MB-231, inoltre, sono in grado di attivare autonomamente la proteina C.
Ci si chiede se la proteina C è disponibile per le cellule di carcinoma mammario data la loro natura extravascolare. In vivo, infatti, la proteina C è sintetizzata dal fegato ed escreta nella circolazione dove esercita la sua attività biologica a livello dell'endotelio. Non sono noti meccanismi di trasporto della proteina C attraverso la barriera endoteliale. Nei tumori, la permeabilità endoteliale è aumentata, per cui non si può escludere che la proteina C possa diffondersi nella matrice sottoendoteliale alle cellule tumorali. Tuttavia sono possibili altre ipotesi. Per esempio è noto che le cellule tumorali esprimono fattore tissutale, il recettore per il fattore VII/VIIa di sintesi epatica. Si è scoperto da poco che il fattore VII può essere sintetizzato dalle cellule tumorali stesse che divengono così macchine procoagulanti interamente autonome (Koizume et al, 2006). Il fattore VIIa, che ha elevata omologia con APC, può legarsi all'EPCR. Infine, esistono proteasi seriniche transmembrana che potrebbero ricoprire il ruolo di APC nella cellula tumorale, fra cui matriptase, una proteasi serinica transmembrana presente costitutivamente nelle cellule MDA-MB-231 e presente anche nel latte umano (List et al, 2006).
L'identificazione della proteasi agonista di EPCR nel cancro della mammella è importante perché riveste un potenziale target terapeutico.
Obiettivi e metodi. 1. Identificare l'eventuale presenza di proteina C nelle cellule tumorali MDA-MB-231 mediante analisi dell' mRNA e della proteina (Western blot). 2. Analizzare se il fattore VIIa può sostituire l' APC nell'azione anti-apoptotica in modo EPCR dipendente. In questi esperimenti, condotti su cellule MDA-MB-231 silenziate e non per EPCR, sarà analizzata per citofluorimetria (legame di annessina V e propidio) l'apoptosi in condizioni basali e dopo stimolo con staurosporina in assenza e presenza di fattore VIIa. 3. Analizzare se matriptase possiede attività antiapoptotica. Sarà analizzato l'effetto dell'aggiunta di anticorpi anti-matriptase sull'apoptosi basale e dopo stimolo delle cellule MDA-MB-231.