Zebrafish come modello per lo studio dei processi di vasculogenesi e angiogenesi. Isolamento e caratterizzazione funzionale di nuovi marcatori: ve-ptp e cl2/dro1
Progetto Il differenziamento e la crescita del sistema vascolare è fondamentalmente un processo che si verifica durante lo sviluppo embrionale e può avvenire attraverso due meccanismi: la vasculogenesi e l'angiogenesi. La vasculogenesi consiste nella formazione di nuovi vasi a partire da precursori indifferenziati (emangioblasto); l'angiogenesi comporta invece la formazione di nuovi capillari a partire da vasi preesistenti. In questi anni zebrafish si è rivelato anche un ottimo modello per lo studio del sistema vascolare. A poco più di 24 ore dalla fecondazione zebrafish presenta circolazione sanguigna e organogenesi avanzata, il confronto tra i vasi sanguinei di zebrafish e quelli degli altri Vertebrati mostra un sorprendente grado di conservazione anatomica e funzionale. Recentemente sono in fase di studio due geni , ve-ptp e dro1, implicati il primo nella corretta funzionalità dei vasi per quanto riguarda la permeabilità fisiologica ed il secondo, da una prima analisi sperimentale, nell'acquisizione dell'identità arteriosa.
Il gene Ve-ptp (Vascular Endothelial-Protein Tyrosine Phosphatase) codifica per una proteina transmembrana appartenente alla sottoclasse delle PTPs receptor-type. L'analisi dei fenotipi di topi mutanti e knock out ha mostrato che il KO di ve-ptp causa gravi difetti a carico del sistema cardio-vascolare.
Nel nostro lavoro abbiamo identificato il gene ve-ptp in zebrafish. L'analisi dell'espressione di ve-ptp mediante ibridazione in situ su embrioni interi a differenti stadi di sviluppo embrionale e larvale precoce ha permesso di rilevare la presenza preferenziale del trascritto a livello del sistema vascolare in via di formazione. Per analizzare il ruolo di ve-ptp durante lo sviluppo del sistema cardio-vascolare abbiamo effettuato dei saggi di perdita di funzione mediante microiniezioni di un oligonucleotide antisenso sintetico (morfolino), complementare ad una sequenza specifica presente sull'mRNA bersaglio. L'analisi in vivo dei fenotipi ottenuti e la loro caratterizzazione a livello morfologico e molecolare ha suggerito che il knock down di questa proteina causa gravi difetti a livello del sistema vascolare e cardiaco.
cl2/dro1 è un gene identificato recentemente, ed in un primo saggio, utilizzando la tecnica dell'ibridazione in situ è stato possibile rilevare la localizzazione dei trascritti che cambia e aumenta di complessità durante lo sviluppo. A 24 hpf zfCL2 appare espresso nel cuore, nell'aorta dorsale, nelle blood islands della coda, nel bottone caudale. Obiettivi della ricerca:
VE-ptp Approfondire l'analisi funzionale mediante ulteriore caratterizzazione sia a livello morfologico che molecolare dei fenotipi osservati in vivo.
Dro1. Sarà avviato un primo screening di saggi di perdita di funzione mediante microiniezione di morfolino specifici. I fenotipi ottenuti saranno analizzati sia a livello morfologico sia a livello molecolare mediante impiego di marcatori artero-venosi.