Analisi dei profili di espressione di microRNA in un modello murino di carcinoma delle isole-pancreatiche
Progetto I processi biologici che presiedono alla progressione da cellula normale a cellula neoplastica e, successivamente, a cellula tumorale angiogenica possono essere proficuamente studiati utilizzando il modello di topo transgenico ideato da Hanahan D. e denominato "RIP-Tag mouse". In questo modello murino, il promotore genico dell'insulina (RIP) viene fuso con il gene codificante l'oncoproteina Tag del virus SV40. La proteina Tag è dotata di elevato potenziale trasformante conferito dall'inattivazione di entrambe le proteine onco-soppressori p53 e Rb. L'elevata selettività di espressione del promotore RIP nelle isole del Langerhans consente all'oncogene Tag di essere trascrittto solo nelle isole pancreatiche, dove ne governera la trasformazione neoplastica anche se con penetranza incompleta. La progressione da cellule beta normali a cellule tumorali è scandita da passaggi ben riconoscibili da un punto di vista istologico, e temporalmente riconducibili a settimane di vita dell'animale. I passaggi della progressione neoplastica nel modello "Rip-Tag mouse" sono i seguenti: 1) Isole normali - età del topo: 4 settimane; 2) Isole iperplastiche - età del topo: 6 settimane; 3) Isole angiogeniche - età del topo: 8 settimane; 4) Carcinoma - età del topo: 10 settimane; 5) Carcinoma metastatico - avviene alla 12-14a settimana di vita del topo che succesivamente muore per la malattia.
I fattori che governano la progressione della malattia non sono ad oggi completamente elucidati e, In particolare, gli eventi molecolari che determinano il cosiddetto "angiogenic switch" non sono noti. Il nostro progetto si propone di indagare nei diversi stadi di progressione della malattia il profilo di espressione di piccoli RNA regolatori non codificanti, detti microRNA. I microRNA presiedono alla regolazione della traduzione degli RNA messaggeri (mRNA) in proteina e determinano l'emivita degli mRNA a livello citoplasmatico. Recenti lavori supportano il coinvolgimento dei microRNA come fattori sia promuoventi sia inibenti la tumorigenesi in vari organi.
Ci proponiamo di analizzare tramite Real Time RT-PCR i livelli di 182 microRNA nelle isole del Langerhans di animali di età 4, 6, 8 e 10 settimane. I campioni, fissati in formalina ed inclusi in paraffina, verranno arricchiti di cellule beta pancreatiche tramite microdissezione laser a partire da sezioni di tessuto colorate in ematossilina. Successivamente l'RNA totale verrà estratto con kit idonei e retrotrascritto con primers specifici. I valori ottenuti di espressione relativa dei microRNA verranno quindi correlati allo stadio della malattia. Il nostro progetto di ricerca ha come obbiettivo di determinare il profilo di miRNA associato al momento definito "angiogenic switch". La caratterizzare molecolare di questo stadio di progressione neoplastica potrà, successivamente, essere verificata in tumori umani in cui gli stadi della malattia sono identificabili istologicamente, quali i tumori del colon o della mammella.