Studio morfologico e morfometrico dell'effetto di radiazioni ionizzanti sul compartimento epiteliale in un modello sperimentale tridimensionale di colture organotipiche di mucosa orale umana
Progetto I cheratinociti della mucosa orale sono il primo citotipo che si trova ad affrontare stimoli di diversa natura rappresentando un'efficace barriera fisiologica grazie alla stratificazione tridimensionale. Il mantenimento dell'integrità strutturale dell'epitelio è garantito dal processo di rinnovamento cui vanno incontro i cheratinociti, definito differenziazione terminale, e dalla presenza di desmosomi. Tali giunzioni intercellulari sono complessi multiproteici transitori composti da diverse proteine tra cui le caderine desmosomiali, suddivise in desmocolline (Dsc) e desmogleine (Dsg). Nella mucosa orale cheratinizzata l'adesione intercellulare nei desmosomi è principalmente mediata da Dsg1 e Dsg3.
Per approfondire le conoscenze relative all'omeostasi dell'epitelio orale risulta fondamentale la messa a punto di approcci alternativi ai test sugli animali. Nel nostro laboratorio è stato precedentemente standardizzato e caratterizzato un modello di colture organotipiche tridimensionali di mucosa orale umana ottenuta da interventi chirurgici. Nelle nostre condizioni sperimentali sono mantenute sia la struttura tridimensionale sia la fisiologica interazione epitelio-mesenchimale.
Lo scopo della ricerca è lo studio della risposta ad una dose singola clinica standard di radiazioni ionizzanti in colture organotipiche di mucosa orale cheratinizzata umana normale. Le biopsie di mucosa orale cheratinizzata saranno prelevate dall'arcata dentaria superiore o inferiore di pazienti volontarie sane consenzienti e non fumatrici con età compresa tra i 30 e 40 anni (n=7) previa visione e firma del consenso informato. I frammenti saranno posizionati in doppio con l'epitelio verso l'alto in un sistema Transwell ed incubati per una notte per ridurre gli effetti acuti successivi all'intervento chirurgico. I campioni verranno esposti ad una singola dose clinica standard di radiazioni ionizzanti (2 Gy) emesse da un irradiatore biologico. I campioni controllo verranno mantenuti a temperatura ambiente durante l'irradiazione e l'esperimento sarà concluso 24 ore dopo l'irradiazione e ciascun paziente sarà rappresentato in entrambi i gruppi sperimentali.
I parametri considerati saranno la proliferazione/spessore epiteliale e l'analisi in immunofluorescenza dell'espressione delle caderine desmosomiali Dsg1 e Dsg3 con anticorpi specifici.
Per valutare il grado di proliferazione cellulare, i campioni saranno incubati per tre ore con medium contenente 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU), un analogo non radioattivo della timidina che viene attivamente e selettivamente incorporato nel DNA delle cellule in fase S. Tale incorporazione sarà rivelata mediante uno specifico anticorpo monoclonale come precedentemente descritto (Donetti et al, 2005). Lo spessore dell'epitelio orale sarà calcolato con il sistema di immagine Image Pro-Plus 4.5 su sezioni istologiche colorate con ematossilina ed eosina.