Ruolo della Sam68 nella regolazione leptina-dipendente dell'espressione del recettore per l'ormone in cellule muscolari scheletriche.

INTRODUZIONE Sam68 fa parte della famiglia delle RNA-binding proteine chiamate STAR (signal transduction and activation of RNA), che operano sia nella trasduzione dei segnali, come proteine adattatrici, sia in processi che controllano il metabolismo dell'RNA, splicing alternativo incluso. E' stato riportato che il recettore della leptina ingaggia Sam68, come molecola adattatrice, nella trasduzione del segnale, determinandone la fosforilazione in tirosina, evento che può regolare la capacità di legame della proteina all'RNA. Esistono diverse isoforme di recettore per la leptina derivate, per splicing alternativo, dal trascritto di un unico gene, e aventi differente capacità funzionale. La isoforma detta lunga (ObRb) è quella funzionalmente più competente sembrando essere responsabile della maggior parte degli effetti ormonali; la forma breve (ObRa) ha competenze trasduzionali limitate. Variazioni nel processamento del pre-mRNA possono quindi condizionare la responsività o la resistenza all'ormone. Il tessuto muscolare scheletrico, importante sede di ossidazione lipidica e di dispendio energetico, è un bersaglio critico della leptina nel mediare alcuni degli effetti periferici dell'ormone. Abbiamo precedentemente dimostrato in cellule muscolari scheletriche murine (C2C12) che: 1) la leptina acutamente modifica l'espressione dell'mRNA per il suo stesso recettore, favorendo l'mRNA per l'isoforma lunga. 2) che gli mRNA per ambedue le isoforme recettoriali coimmunoprecipitano con Sam68 suggerendo che la leptina possa orientare l'attività di Sam68 verso la modulazione delle isoforme del suo stesso recettore e in questo modo autoregolare la sensibilità tessutale. OBIETTIVO Vogliamo ora indagare: 1) se Sam 68 rivesta effettivamente un ruolo indispensabile nello splicing alternativo dell'mRNA per il recettore della leptina utilizzando la tecnica del silenziamento della proteina 2) Se il fenomeno di rimodellamento degli mRNA per ObRa e ObRb indotto acutamente dalla leptina si ripercuota effettivamente sulle isoforme recettoriali presenti sulla membrana cellulare con esperimenti di immunocitochimica. METODI RNA interference. Cellule C2C12, controllo e trattate acutamente con leptina, saranno trasfettate con dsRNA fluorescenti utilizzando Lipofectamina RNAiMAX allo scopo di ottimizzare le condizioni di trasfezione. Quindi verranno utilizzati siRNA per Sam68 (Invitrogen); il silenziamento della proteina verrà verificato mediante l'analisi in immunoblot di estratti totali proteici e le eventuali variazioni dell'espressione di mRNA per ObRb e ObRa verrà valutata mediante la tecnica della PCR eseguita dopo estrazione dell'RNA totale. Immunocitochimica Cellule C2C12 saranno coltivate su vetrini; dopo trattamento con leptina, le cellule saranno fissate, bloccate con 5% BSA, incubate con anticorpi anti-ObRb e anticorpi secondari fluorescenti. I preparati saranno osservati con microscopio a fluorescenza e valutati con un analizzatore di immagini.