CARATTERIZZAZIONE MORFOLOGICA, FUNZIONALE E MOLECOLARE DI CELLULE STAMINALI NEONATALI DA DIFFERENTI STRUTTURE DEL CORDONE OMBELICALE DI CAVALLA E BOVINA
Progetto La seguente proposta di ricerca vuole sviluppare un protocollo per la raccolta,l'isolamento e la conservazione di cellule staminali mesenchimali utilizzando la componente stromale del cordone ombelicale, valutandone le caratteristiche nella specie equina e bovina di interesse per la medicina rigenerativa veterinaria. Tale ricerca è la prosecuzione ed il completamento del progetto presentato nell'anno precedente. Le presunte cellule mesenchimali saranno isolate dalla gelatina di Warthon, dalla parete dei vasi, dal sangue refluo cordonale e dalla porzione amniotica del cordone del cordone ombelicale di puledri e vitelli alla nascita con lo scopo di valutare quale di queste strutture sia da ritenersi la più idonea come sorgente di staminali neonatali nei riguardi della facilità di prelievo, della protezione da inquinamento batterico e delle caratteristiche di pluripotenza delle cellule isolate. Le cellule mesenchimali saranno isolate mediante digestione enzimatica valutando differenti protocolli quali collegenasi, tripsina, diaspasi singolarmente od associate in cordoni mantenuti in terreni di trasporto/conservazione per periodi differenti (da 12 a 72 ore) per valutare l'effetto del fattore tempo nel protocollo di gestione del cordone dal momento della nascita a quello dell'utilizzo. Le presunte staminali verranno coltivate ad una concentrazione 10 alla5 cellule/ml (0.5 ml/pozzetto) in piastre petri impiegando come terreno di coltura il Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) contenente siero fetale di vitello al 20%, fattori di crescita ed antibiotici (200 U/ml penicillina, 200 g/ml streptomicina) ed incubate a 38° C
in atmosfera umidificata con CO2 al 5%. La crescita cellulare verrà controllata ogni 24 ore e la vitalità cellulare
determinata mediante test MTT. Impiegando la valutazione dell'espressione di Nanog, SSEA3, SSEA4 e Oct4, proteine marker del mantenimento della pluripotenza cellulare, sarà controllato il grado di mantenimento dello sdifferenziamento cellulare nelle mesenchimali. I risultati attesi dalle sperimentazioni riguarderanno: individuazione delle strutture del cordone ombelicale più adatte come fonte di staminali, banca di cellule staminali equine da cordone ombelicale, protocolli sperimentali per la produzione in vitro di cellule staminali neonatali, messa a punto di test
diagnostici molecolari specifici della specie equina e bovina per la caratterizzazione di cellule staminali mesenchimali.