Analisi del meccanismo di autoinibizione di ACA8, una Ca2+-ATPasi della membrana plasmatica di Arabidopsis thaliana, mediante l'uso di chimere
Progetto La ricerca rappresenta lo sviluppo di quella finanziata con fondi FIRST 2007. Nel laboratorio del proponente da anni si studia il meccanismo di autoinibizione delle P-type ATPasi utilizzando come modello ACA8, una Ca2+-ATPasi della membrana plasmatica (PM) di A. thaliana. L'enzima appartiene al sottogruppo IIB delle P-type ATPasi caratterizzate dall¿interazione con la calmodulina (CaM) a livello di un dominio autoinibitorio la cui azione è soppressa dal legame con la CaM. In ACA8, il dominio N-terminale (N-te) contiene sia il dominio autoinibitorio, responsabile dell'interazione con una porzione intramolecolare della pompa, sia la regione in grado di legare la CaM e queste 2 regioni sono parzialmente sovrapposte. Anche la PM Ca2+-ATPasi degli animali e la PM H+-ATPasi delle cellule vegetali, P-type ATPasi strettamente correlate con ACA8, sono caratterizzate dalla presenza di un dominio regolativo terminale con azione autoinibitoria che viene rimossa in seguito all'interazione con CaM e proteine 14-3-3 rispettivamente; tuttavia questo dominio è localizzato al C-te delle proteine.
Per testare l'ipotesi che differenti P-type ATPasi possano condividere un meccanismo comune di regolazione indipendentemente dalla localizzazione del dominio regolativo, dall'organismo, dallo ione trasportato e dalla sottofamiglia di appartenenza, è stato utilizzato il cDNA di una forma di ACA8 costitutivamente attivata e insensibile alla CaM (D74ACA8) per costruire mutanti in cui il dominio N-te di ACA8 (74 o 116aa) è stato inserito a livello del C-te della proteina. Inoltre, sono state costruite chimere in cui la forma deregolata di ACA8 è fusa al dominio C-te autoinibitorio dell'isoforma AHA1 di PM H+-ATPasi di A. thaliana. Tutti i mutanti sono stati espressi nel ceppo di lievito K616 che essendo privo di tutte le Ca2+-ATPasi endogene rappresenta un ospite ideale per l'overespressione e la caratterizzazione di Ca2+-ATPasi eterologhe. Si intende studiare il comportamento di questi mutanti analizzandone la funzionalità e lo stato di autoinibizione in vivo valutando la loro capacità di complementare il fenotipo di K616 su terreno selettivo. Un'analisi più approfondita sarà eseguita nella frazione microsomale di K616 misurando l'attività enzimatica dei mutanti, saggiata sia come idrolisi di ATP che come trasporto di Ca2+, in funzione di concentrazioni crescenti di CaM o in presenza o in assenza di proteine 14-3-3. Ci si propone inoltre di costruire e analizzare nuove chimere in cui D74ACA8 sia fuso con il dominio autoinibitorio C-te dell'isoforma PMCA4b della Ca2+-ATPasi IIB umana. Il clone di PMCA4b gentilmente fornito dal Prof. H. Adamo è già disponibile nel laboratorio del proponente. Se le chimere risulteranno autoinibite, costituiranno una forte evidenza a favore dell'ipotesi che esista un comune meccanismo di autoinibizione, con implicazioni di grande interesse non solo in biologia vegetale poiché le ATPasi di tipo P sono presenti in tutti gli organismi.