EFFICACIA DI UN ANTICORPO AD ELEVATA AFFINITA' ENDOTELIALE, DIRETTO CONTRO LA FRAZIONE 5 DEL COMPLEMENTO, NELLA PREVENZIONE DEL DANNO DA ISCHEMIA RIPERFUSIONE IN UN MODELLO DI TRAPIANTO RENALE NEL SUINO
Progetto Lo studio si propone di utilizzare un nuovo anticorpo murino ottenuto da una phage display library di leucociti umani, diretto contro il componente C5 del complemento che inibisce il taglio proteolitico della molecola C5 nei due frammenti C5a e C5b. Tale anticorpo (single chain fragment variable) viene quindi addizionato di catena fissa ottenuta dalle IgG suine e di un segmento (RGB) che ne aumenta l¿affinità per le cellule endoteliali (ScFv anti C5 minibody-RGB). L¿anticorpo Anti-C5 è stato caratterizzato tramite studi funzionali in vitro che ne hanno evidenziato la capacità di legare specificatamente la molecola C5 ed inibire l¿attivazione del complemento. Lo studio proposto valuterà l¿impiego di (anti-C5 minibody RGD) in un modello di allotrapianto renale nel maiale. Lo studio verrà suddiviso in tre fasi allo scopo di valutare l¿efficacia del farmaco e il modo di somministrazione proposto.
Modello sperimentale : In una prima fase verranno utilizzati dei maiali (White Largebreed) del peso di 20-25 kg. Entrambi i reni verranno prelevati e perfusi ex vivo con dosi crescenti di soluzione di antiC5-RGD (1 mg, 2 mg) e mantenuti in ipotermia a 4°C per 24 e 48 ore. Su questi reni verranno quindi eseguiti studi di imaging (RMN e immunoistochimica) per valutare il grado di saturazione endoteliale da parte dell¿anticorpo e la sua persistenza nel tempo determinando la concentrazione teoricamente più efficace. In una seconda fase, si procederà al modello di autotrapianto. Nel maiale, in anestesia generale si procederà al prelievo del rene sinistro, che verrà perfuso al banco con la soluzione di antiC5-RGD e mantenuto in soluzione di Celsior a 4°C per 48 ore. Successivamente verrà eseguito l¿autotrapianto del rene sullo stesso maiale e si procederà contestualmente alla nefrectomia del rene destro. E¿ previsto un gruppo di controllo (3 animali) che riceverà trattamento con placebo (Fisiologica)
Sull¿animale verranno eseguiti i seguenti studi : Studi istologici : valutazione dell¿apoptosi tubulare (TUNEL e DNA laddering,) su reni 1 ora, 3 e 7 giorni dopo la riperfusione dell¿organo. Valutazione istologica del danno tubulare (metodo semiquantitativo) su campioni di tessuto ottenuti durante gli stessi periodi. Valutazione ultrastrutturale del danno endoteliale mediante microscopia elettronica. Studio funzionale : Determinazione di Creatininemia, Azotemia, Ionemia, Clearance della Creatina, Ionuria, Proteinuria, Enzimuria (GGT, ALP) in 3° e 7° giornata postoperatoria. Studio morfologico : ecocolodppler renale con misurazione degli indici di resistenza in 3° e 7° giornata postoperatoria. Studio molecolare : espressione di molecole di adesione (ELAM, ICAM, VCAM), citochine pro-infiammatorie (IL-1, IL-6, TNF), geni pro-e anti-apototici (BAX e Bcl2) mediante Real Time PCR. La terza fase prevede la comparazione dei reni trapiantati trattati con antiC5-RGD con i reni non trattati, mediante studio di imaging (RMN) del rene, prelevato in 3° giornata postoperatoria