I tubetti pollinici delle Angiosperme rappresentano un attraente modello per studiare i meccanismi coinvolti nel processo di crescita
asimmetrico e nel riciclaggio della membrana plasmatica. Il tubetto pollinico segue un meccanismo di crescita basato sul trasporto e sull'accumulo di vescicole di secrezione nella regione apicale dove queste si fondono in una zona ristretta della membrana plasmatica, secernendo materiale per la costruzione di nuova parete e fornendo al contempo nuovi segmenti di membrana plasmatica per la struttura in crescita.Il processo di crescita polarizzato richiede che molte condizioni siano mantenute all'interno della cellula, compresa una differente composizione proteica in diverse zone della membrana plasmatica. L'endocitosi, il
processo di internalizzazione selettiva di segmenti di membrana plasmatica, rappresenta uno dei meccanismi coinvolti nella regolazione sia della composizione e della economia della plasma membrana che dell' internalizzazione di molecole esterne che, in tubetti pollinici cresciuti in vivo, potrebbero svolgere un ruolo importante nel regolare l'allungamento del tubetto. Lo scopo di questo progetto di ricerca è quello di studiare il contributo del citoscheletro (Mts e Afs)nell'internalizzazione e nel trasporto degli endosomi ai diversi compartimenti membranosi.
PIANO SPERIMENTALE
1-Agenti che depolimerizzano Afs e Mts (latrunculina B e oryzalina/nocodazolo) saranno usati in tubetti pollinici cresciuti in vitro. Esperimenti preliminari saranno condotti inizialmente per testare le concentrazioni ed i
tempi di incubazione più convenienti dei due agenti depolimerizzanti. In questo caso le cellule saranno fissate e processate per rivelare
la presenza di Afs e Mts usando phalloidina-texas red e anticorpi anti-tubulina. I campioni saranno poi osservati al microscopio laser confocale. Una volta stabilite le concentrazioni ed i tempi di incubazione ottimali, esperimenti di internalizzazione saranno condotti usando FM4-64/FM1-43 in assenza ed in presenza di latrunculina o oryzalina/nocodazolo. La dinamica dei processi di endocitosi sarà registrata in vivo, in tempo reale usando il microscopio laser confocale. I risultati di questi esperimenti dovrebbero fornire dati sul contributo di entrambi i sistemi filamentosi
sull'internalizzazione. parte di esse nella regione apicale.
2-Markers specifici per il Golgi (BodiPy ceramide) e per i vacuoli (Lysosensor)saranno usati, insieme con FM4-64/FM1-43 per valutare il ruolo dei Mts e degli Afs nel trasporto degli endosomi sia al Golgi che ai compartimenti acidi. La comparazione del livello di colocalizzazione fra i markers in esperimenti controllo ed in presenza degli inbitori sarà condotta usando il software ImageJ.