Struttura, dinamica e proprietà di riconoscimento molecolare di RNA e DNA-oligomeri mediante spettroscopia NMR e metodi di chimica computazionale

Gli acidi nucleici hanno ultimamente dimostrato di essere valide alternative agli anticorpi nello sviluppo di nuovi sensori molecolari, portando alla creazione di un' ampia gamma di sistemi di riconoscimento molecolare. Rispetto agli anticorpi, gli aptameri presentano numerosi vantaggi: stabilità al calore, tolleranza ad ampie variazioni di pH e forza ionica, possibilità di essere sintetizzati chimicamente. Di recente sono stati messi a punto svariati sistemi di riconoscimento della proteina prione, nella sua variante sensibile alla scrapie, basati su DNA ed RNA-oligomeri. In particolare, è stata identificata una sequenza di 21 nucleotidi, dotata di elevata affinità (Kd=14.6 nM) nei confronti del prione [Mercey R, Lantier I, Maurel MC, Grosclaude J, Lantier F, Marc D. Arch Virol. (2006), 151(11),2197-214]. Nonostante il notevole interesse riguardo questo tipo di sistemi, non esistono attualmente studi riguardanti la loro struttura tridimensionale e come essa sia in grado di influenzare le proprietà di riconoscimento molecolare. La ricerca proposta prevede la sintesi in fase solida (in stretta collaborazione con il gruppo di ricerca diretto dal Prof. R. Eritja, CSIC, Barcellona) e la successiva analisi strutturale mediante metodi spettroscopici e computazionali di oligodesossi- e oligoribonucleotidi selezionati specificamente per il riconoscimento di particolari target biologici, quali ad es. la proteina prione infettiva. Gli aptameri sintetizzati serviranno per lo sviluppo di nuovi agenti di contrasto altamente specifici per la diagnosi precoce mediante tecniche MRI (Magnetic Resonance Imaging) delle malattie da prione [Kouassi GK, Wang P, Sreevatan S, Irudayaraj J. Biotechnol Prog. (2007) 23(5, 1239-44]. Verranno sperimentate varie strategie sintetiche, a partire da 2'-fluoro-2'-desossiribonucleosidi opportunamente funzionalizzati, allo scopo di produrre le molecole di interesse in elevata purezza (> 98%) e quantità (dell' ordine di svariate micromoli). Verranno inizialmente selezionate varie sequenze di RNA, di lunghezza compresa tra 19 e 40 basi, contenenti domini particolari (es. hairpin) costituenti la porzione minima degli aptameri del prione. In seguito verrà affrontata la sintesi su fase solida degli aptameri completi. L' analisi della struttura tridimensionale degli aptameri, anche in complesso con particolari segmenti della proteina prione, verrà condotta mediante esperimenti NMR multidimensionali omo ed etero-nucleari per l' attribuzione completa delle risonanze protoniche e la misura delle distanze interatomiche in fase isotropica e parzialmente orientata. La struttura molecolare in soluzione sarà quindi determinata da calcoli di "restrained molecular dynamics". A tal fine verranno utilizzati programmi di calcolo (XPLOR, NAMD, CHARMM, GROMACS), installati su piattaforme di calcolo a multiprocessore che prevedono campi di forze specifici per gli acidi nucleici (CHARMM27).