Controllo epigenetico e teratogenesi: studio del ruolo di acetilazione e metilazione istonica nell'induzione di malformazioni assili da parte di acido valproico.
Progetto Sia nelle cellule adulte che nelle cellule embrionali, modificazioni istoniche (acetilazione, metilazione, fosforilazione, ubiquitinazione) sono alla base del controllo epigenetico dell'accessibilità del DNA a fattori di trascrizione, e quindi del controllo dell'espressione genica.
Acido valproico (VPA) è un farmaco usato da più di 50 anni per il controllo dell'epilessia, è in sperimentazione come antitumorale ed è un noto teratogeno sia nell'uomo che negli animali da esperimento. Le attività antineoplastica e teratogena di VPA sembrerebbero correlate alla inibizione delle deacetilasi istoniche (HDAC). Recentemente, il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato nell'embrione una correlazione tra inibizione delle HDAC- iperacetilazione istonica a livello dei somiti- malformazioni allo scheletro assile indotte da varie molecole, tra le quali VPA.
Tra i meccanismi descritti per spiegare la genesi di malformazioni da VPA, vi sono anche alterazioni del metabolismo di aminoacidi, tra i quali metionina (Meth). Ipometioninemia è stata descritta dopo 1 ora dal trattamento di femmine gravide di topo con VPA. Il pre-trattamento con Meth (1/2 ora prima dell¿esposizione a VPA) è stato correlato alla diminuzione della frequenza di malformazioni al tubo neurale, mentre embrioletalità e ritardi di sviluppo sembrerebbero aumentare.
Scopo della ricerca è valutare gli effetti del pre-trattamento con Meth sullo sviluppo dello scheletro assile, gli effetti di VPA sulla metilazione istonica embrionale, gli effetti di VPA sull'attività di metilasi embrionali e di cercare di correlare i dati ottenuti con gli effetti di VPA sulle HDAC embrionali.
Femmine gravide di topo verranno trattate al giorno 8 post coitum con 70 mg/kg peso corporeo di Meth (dose efficace per la prevenzione di malformazioni al tubo neurale indotte da VPA) e quindi, dopo ½ ora, con una dose teratogena di VPA (400 mg/kg). Entrambi i trattamenti verranno eseguiti per via intraperitoneale. Gruppi di controllo saranno trattati con soluzione fisiologica in entrambi i momenti di trattamento, con soluzione fisiologica e con VPA ovvero con Meth e quindi con soluzione fisiologica. Gli embrioni, espiantati dopo 1 o 3 ore dall¿ultimo trattamento, verranno congelati e quindi utilizzati per il Western blot o fissati in paraformaldeide 3% e quindi utilizzati per tecniche di immunoistochimica. In entrambi i casi verranno utilizzati anticorpi primari anti-istone H4 iperacetilato, anti- istone H3 metilato a livello della lisina 4 (H3K4), anti-istone H3 metilato a livello della lisina 9 (H3K9). I feti, espiantati da alcune femmine sacrificate a termine di gestazione (18° giorno post coitum), saranno colorati tramite la doppia colorazione dello scheletro per osso e cartilagine.
Al fine di misurare l'attività enzimatica embrionale, verranno utilizzati estratti nucleari di cellule HeLa o di embrioni E8 di topo non trattati. Verrà valutata l'attività di HDAC e di metilasi in presenza di VPA.