Espressione di ZAR-1, DMNT-1 e Nucleoplasmine 1, 2 e 3 durante la crescita e differenziamento dell'ovocita di bovino
Progetto L'architettura della cromatina materna subisce profondi cambiamenti durante la follicologenesi tramite interventi strutturali di condensazione e rimodellamento. Tali modificazioni svolgono un ruolo fondamentale nel processo di acquisizione della capacità di sviluppo del gamete femminile (Lodde et al., 2007 Mol Reprod Dev 74: 740-749) presumibilmente regolando l'espressione di geni coinvolti nel controllo dei successivi processi di embriogenesi e morfogenesi. Al fine di verificare questa ipotesi, nel corso dei programmi finanziati nei precedenti anni, abbiamo intrapreso una serie di studi volti a verificare se il rimodellamento della cromatina potesse influenzare l'espressione di geni ritenuti essenziali per un corretto sviluppo embrionale. Tali geni codificano per la nucleoplasmina 1 2 e 3, coinvolte nell'organizzazione del compartimento nucleare, la "zygotic arrest 1", essenziale nella transizione dallo stadio di zigote all'embrione di due cellule e la DNA metiltransferasi 1, coinvolta nel controllo della metilazione dei geni sottoposti ad imprinting genomico. Gli studi sino ad ora condotti hanno dimostrato che, indipendentemente dalla configurazione della cromatina, gli RNA messaggeri codificati dai geni considerati sono presenti in tutte le fasi di differenziamento dell'ovocita (Lodde et al., 2007 Biol Reprod 77:1:345). Questi risultati suggeriscono che il rimodellamento della cromatina potrebbe influenzare l'espressione di tali geni non semplicemente determinandone l'attivazione o il silenziamento, ma bensì influenzandone i livelli di trascrizione o anche intervenendo a livello post-trascrizionale. Obbiettivo specifico. Scopo della presente ricerca sarà dunque quello di determinare eventuali variazioni quantitative dei livelli degli RNA messaggeri e, successivamente, di verificare la localizzazione delle proteine da essi codificate. L'indagine sarà condotta in ovociti della specie bovina, scelta come modello, in almeno 5 esperimenti indipendenti. Gli ovociti saranno raccolti da follicoli ovarici antrali precoci e follicoli antrali medi e successivamente suddivisi in 4 classi in base alla configurazione della cromatina (Lodde et al., 2007 Biol Reprod 77:1:345). Le variazioni dei livelli di espressione genica saranno verificate attraverso indagini biomolecolari condotte mediante PCR semiquantitativa in cui i livelli di espressione dei geni in esame saranno confrontati con i livelli di espressione di geni costitutivi, quali l'istone H2A-Z ed utilizzando trascritti esogeni di controllo. Successivamente, la presenza e la localizzazione dei prodotti proteici saranno analizzati attraverso indagini immunoistochimiche e microscopia confocale ed analisi semi-quantitativa. Risultati attesi. Da questa ricerca si potranno trarre precise indicazioni su i meccanismi attraverso cui le modificazioni dell'architettura del nucleo del gamete femminile, nelle fasi finali della follicologenesi, si ripercuotono sulla sua potenzialità di generare un embrione vitale.