IN SITU HYBRIDIZATION (ISH) PER LA LOCALIZZAZIONE DI SEQUENZE MICROCHIMERICHE IN TESSUTI DI BOVINO
Progetto Recentemente il nostro gruppo e altri hanno dimostrato il fenomeno del microchimerismo nella specie bovina. Con il termine di microchimerismo si intende la presenza in un individuo di cellule o DNA appartenenti ad un individuo geneticamente distinto. Anche nella specie bovina come in quella umana il fenomeno è bidirezionale, infatti Hiendleder e collaboratori nel 2003 hanno rilevato il passaggio di materiale transplacentare dalla bovina al feto, mentre il nostro gruppo ha dimostrato il passaggio dal feto alla madre. Il passaggio di materiale genetico dal feto alla madre è stato verificato con due diversi sistemi (ricerca di sequenze transgeniche nel sangue di bovine riceventi di feti transgenici e ricerca di sequenze del cromosoma Y in madri naturali di vitelli maschi) sia in gravidanze normali, sia in gravidanze con embryo transfer. Il microchimerismo ha un rilevante impatto nella gestione di animali clonati o transgenici data l¿importanza della specie bovina in campo agroalimentare e il crescente impiego delle biotecnologie a scopo produttivo e riproduttivo.
Allo scopo di caratterizzare il microchimerismo in termini di permanenza nel tempo del materiale genetico ed eventuale localizzazione in tessuti o organi specifici, abbiamo condotto degli studi mediante Real-Time PCR per la ricerca delle sequenze esogene nei tessuti di bovine wild type madri di vitelli transgenici. Più precisamente 4 bovine sono state scelte in quanto altamente positive per la ricerca delle sequenze esogene nel sangue; a 3 anni dal parto sono state sacrificate e un vasto pannello di organi è stato prelevato e analizzato mediante Real-Time PCR per la ricerca delle suddette sequenze. I bovini transgenici sono stati prodotti e mantenuti dai collaboratori dell¿AgResearch, Ruakura Research Centre, Hamilton, New Zealand. I risultati hanno evidenziato, analogamente a quanto si verifica nella specie umana, la permanenza di sequenze esogene in alcuni tessuti.
L¿obiettivo del presente progetto è confermare mediante la tecnica ISH (In Situ Hybridization) i risultati ottenuti sui tessuti mediante Real-Time PCR. Gli stessi tessuti analizzati a livello molecolare verranno testati anche con questa metodica. Allo scopo si allestirà una sonda a DNA, costituita da porzioni del costrutto utilizzato per la produzione di embrioni transfenici e quindi specifica per le sequenze esogene.
Verranno testati come controlli negativi gli stessi organi e tessuti prelevati da animali non transgenici e come controlli positivi i tessuti dei bovini transgenici.