Presupposti: Il Rotavirus è la causa eziologia più comune di gastroenterite (GE) acuta severa nei bambini di tutto il mondo. Nei Paesi in via di sviluppo la GE da Rotavirus è causa di morte infantile essendo responsabile di circa 500.000 decessi/anno in bambini di età <5 anni. Nei Paesi industrializzati quasi tutti i bambini sviluppano una GE acuta da Rotavirus nei primi 5 anni di vita; molti casi necessitano di visita medica e/o ricovero, comportando ogni anno enormi costi sanitari diretti ed indiretti.
I Rotavirus umani possiedono un nucleocapside costituito da 3 capsidi che racchiudono un genoma virale costituito da 11 segmenti di dsRNA; in base alla tipizzazione delle proteine strutturali del capside VP4 (P) e VP7 (G) sono attualmente classificati in 10 G e 10 P tipo-specifici. Il ceppo G1P[8] è il tipo a maggior prevalenza ed ubiquitario; i ceppi G2P[4], G3P[8] e G4P[8] sono distribuiti a livello mondiale ma con variazioni geografiche e temporali, mentre recentemente sono emersi i ceppi G9P[8] e G9P[6].
L'identificazione dei ceppi virali circolanti è di estrema importanza per determinare se la loro distribuzione in un Paese riflette i sierotipi selezionati per l'allestimento dei vaccini anti-Rotavirus.
Obiettivi della ricerca:
-Caratterizzare i Rotavirus circolanti nei bambini ospedalizzati per GE acuta in Lombardia;
-Determinare la correlazione tra genotipo virale e grado di severità della sintomatologia clinica.
Descrizione della ricerca:
Studio multicentrico che prevede l'arruolamento di circa 300 bambini di età <5 anni ricoverati per GE acuta presso diversi reparti di Pediatria della Lombardia.
Di ogni bambino verrà raccolto un campione di feci e uno di siero, e mediante apposita scheda verranno raccolti i dati anamnestici e clinici.
Su ciascun campione di feci verrà eseguita la caratterizzazione del ceppo di Rotavirus mediante metodi molecolari che prevedono l'esecuzione di RT-PCR verso entrambe le regioni VP7 e VP4 del genoma di Rotavirus.
Sui campioni di siero verrà invece eseguita la ricerca dell'antigene mediante test immunoenzimatici (EIA) e/o dell'RNA virale mediante RT-PCR.
In breve, l'RNA di Rotavirus verrà estratto da sospensione fecale al 10% o da siero. L¿RNA estratto sarà quindi risospeso in H2O sterile RNAasi free ed utilizzato random primers per la reazione di retrotrascrizione a cDNA. Per la determinazione dei genotipi G e P di Rotavirus, i campioni verranno quindi analizzati con primers tipo-specifici mediante hemi-nested PCR. In un primo step di PCR verrà amplificato un frammento (881 nt) del gene che codifica per VP7 utilizzando primers consenso, mentre i diversi genotipi G verranno determinati in un secondo step di PCR con primers specifici per G1, G2, G3, G4, G9 e G10. Analogamente, verrà amplificato un frammento di VP4 (876 nt) utilizzando primers consenso, mentre il genotipo P verrà ottenuto utilizzando primers specifici per P[4], P[6], P[8], P[9] e P[11]