Sviluppo di un modello in vitro per valutare la tossicità di composti antimalarici nella differenziazione eritroide
Progetto Il nostro laboratorio si occupa da tempo di patogenesi e terapia della malaria che è una tra le più diffuse malattie parassitarie nel mondo. Nelle aree endemiche, il principale gruppo a rischio tra gli adulti è costituito dalle donne alla prima gravidanza, nelle quali la malaria è molto grave e causa aborto spontaneo, parti prematuri o morte. Con la diffusione della resistenza a clorochina, non ci sono farmaci efficaci e sicuri da usare nel primo trimestre di gravidanza. Al momento, si ricorre al trattamento preventivo intermittente (IPT) che consiste di due dosi di sulfadossina-pirimetamina dal secondo trimestre (SA Ward et al. Infection.thelancet Feb2007). La terapia antimalarica combinata con derivati di artemisinina (ACT), che è molto efficace e sicura nei bambini e negli adulti, non è consigliata in gravidanza perché le artemisinine (ARM) sono risultate tossiche in modelli animali(embrioni di ratto), in cui si è osservata forte inibizione della vasculogenesi e della eritropoiesi. Inibizione dell'angiogenesi è stata da noi confermata di recente utilizzando diversi derivati di ARM (D'Alessando S et al Toxicology 2007). Mancano però dati certi nelle donne gravide.
C'è necessità quindi di studiare l'interazione di nuovi antimalarici, in particolare di ARM e derivati, con il processo di eritropoiesi umana per identificare farmaci efficaci e sicuri che possano essere usati come IPT anche nel I semestre di gravidanza. Lo scopo del presente progetto è di sviluppare un modello in vitro di eritropoiesi umana. Verrà utilizzata la leucemia mieloide K562 che in condizioni normali sintetizza solo emoglobina fetale ed embrionale, mentre, sotto lo stimolo di induttori, quali emina, protoporfirina IX e acido butirrico, inizia a produrre emoglobina adulta. Il processo si completa in sei giorni. La differenziazione cellulare verrà confermata mediante 1) stima della percentuale di cellule positive alla colorazione con benzidina, che forma un complesso blu con l'emoglobina adulta; 2) determinazione dell'espressione di catene beta della globina mediante PCR o western blot ; 3) determinazione di HSP70 e di Caspasi-3, che aumentano durante la sintesi di emoglobina adulta; 3) produzione di Interleuchina-8, fattore pro angiogenico, mediante ELISA. Gli studi potranno poi essere estesi a cellule CD34+ prese dal sangue periferico.
Esperimenti preliminari condotti usando didroartemisinina (DHA), il metabolita attivo di ARM, hanno dimostrato che DHA inibisce la sintesi dell'emoglobina adulta nelle cellule K562 in modo dose-dipendente, indipendentemente dall'agente differenziante utilizzato. Questi risultati sono in linea con i dati di diseritropoiesi riportati negli animali. Ci proponiamo di validare il modello con altri antimalarici della famiglia delle ARMs o chinoline, già in uso o di neosintesi, per valutarne la tossicità sull' eritropoiesi, studiarne i meccanismi molecolari e arrivare ad identificare nuovi interventi terapeutici per la malaria in gravidanza