PRODUZIONE DI BIOFILM E DIVERSA ESPRESSIONE DEI GENI ALS IN CELLULE SESSILI E PLANCTONICHE DI CANDIDA ALBICANS
Progetto Candida albicans è una frequente causa di infezione del torrente circolatorio, spesso associata alla colonizzazione di impianti protesici o di cateteri endovascolari con formazione di biofilm. I biofilm sono rappresentati da una densa rete di cellule lievitiformi, pseudoife ed ife racchiuse in una matrice estracellulare. Le proteine superficiali della parete cellulare dei funghi svolgono un ruolo importante nella formazione del biofilm. Queste proteine hanno una duplice funzione: partecipano allo sviluppo ed organizzazione cellulare del fungo ed interagiscono con ospiti animali o vegetali mediando il processo iniziale di colonizzazione (adesine); ne sono esempi le proteine superficiali idrofobiche e leganti i peptidi di C. albicans e di C. glabrata(rispettivamente ALS ed EPA). La formazione di biofilm in Candida è un processo complesso che si svolge in più tappe: inizia con l'adesione ad un substrato esterno (in medicina un particolare tessuto o un dispositivo medico), prosegue con la proliferazione cellulare e la produzione di pseudoife ed ife, e termina con lo stadio di maturazione in cui si assiste alla repressione della crescita unicellulare e all'incremento di quella ifale, il tutto è imbrigliato nella matrice extracellulare o biofilm. Le cellule microbiche (sessili) organizzate in biofilm sono molto diverse da quelle planctoniche. Inoltre, durante le diverse tappe di formazione del biofilm, l'espressione di alcuni geni risulta diversa da quella osservata nelle cellule planctoniche.
In questo contesto intendiamo studiare: a) la capacità di ceppi di C. albicans responsabili di candidemia di formare biofilm in vitro; b) la possibile diversa espressione nelle cellule sessili e planctoniche dei geni ALS; c) l'eventuale diverso profilo di sensibilità agli antifungini delle cellule planctoniche e sessili dei ceppi produttori di biofilm in vitro.
I biofilm saranno ottenuti in piastre microtiter a 96 pozzetti da una sospensione cellulare standard in RPMI-1640 ed incubando per 48 ore a 37°C. La formazione del biofilm sarà valutata utilizzando il saggio di riduzione di XXT (2,3-bis-2-metossi-4-nitro-5-sulfo-fenil-2H-tetrazolio-5-carbossianilina), che fornisce una misura semiquantitativa dell'attività metabolica delle cellule nel biofilm. I ceppi produttori di biofilm saranno ulteriormente caratterizzati mediante real time PCR per la possibile diversa espressione nelle cellule sessili e planctoniche dei geni (ALS1 ed ALS3) codificanti per le proteine di adesione. Per determinare i pattern di chemio-sensibilità delle cellule sessili da biofilm, la valutazione dell'attività dei farmaci antifungini sarà effettuata mediante saggio di riduzione di XXT.
Il nostro principale obiettivo è di ottenere una migliore comprensione dei meccanismi molecolari che intervengono nella formazione del biofilm e nell'eventuale resistenza ai farmaci antifungini delle cellule sessili per le implicite ricadute sulla salute umana e l'attuazione di strategie di prevenzione.