L'endotelio riveste l'albero vascolare ed è cruciale nel mantenere l'integrità della parete vascolare. Disfunzioni endoteliali sono infatti cruciali nell'aterosclerosi, ipertensione e trombosi. Tra i fattori che promuovono alterazioni endoteliali, attenzione merita la concentrazione di magnesio (Mg), che è coinvolto in una vasta gamma di reazioni biochimiche e di importanti funzioni biologiche. Si noti che l'ipomagnesemia è frequente nei paesi occidentali e studi epidemiologici ne evidenziano un ruolo patogenetico nelle malattie cardiovascolari e nella sindrome metabolica. Le cellule endoteliali sono molto sensibili alla variazione delle concentrazioni del Mg extracellulare; tuttavia, le nostre conoscenze sull'omeostasi cellulare di questo catione è incompleta. Dati biochimici e molecolari indicano l'esistenza di trasportatori che regolano influsso/efflusso di Mg. Recentemente abbiamo dimostrato l'espressione di uno dei canali trasportatori del Mg, TRPM-7, nell'endotelio. Proponiamo di studiare il ruolo funzionale di TRPM7 in cellule endoteliali umane (EC). Per questo, trasfetteremo EC con vettori in cui è clonato TRPM7. Inoltre, mediante un approccio di siRNA, silenzieremo l'espressione di TRPM7. In queste cellule determineremo i livelli di TRPM7 mediante western blot e studieremo il trasporto del Mg mediante microscopia confocale utilizzando sonde fluorescenti derivate dall'8-idrossichinolina con alta affinità e specificità per il Mg. Si studierà quindi la funzionalità delle cellule che esprimono vari livelli di TRPM7. A intervalli regolari e per almeno un mese, conteremo mediante cell counter le cellule. Si analizzerà anche la loro distribuzione nelle varie fasi del ciclo cellulare mediante citofluorimetria a flusso e l'espressione di cicline, chinasi ciclino-dipendenti e loro inibitori mediante western blot. In parallelo, verranno condotti esperimenti per comprendere se viene modulato il tasso di apoptosi. Dato che una disfunzione endoteliale è associata a malattie cardiovascolari, studieremo una serie di parametri indicatori della funzionalità endoteliale. Misureremo la sintesi di ossido nitrico (NO), importante vasodilatatore implicato nel mantenimento del tono vasale, e l'espressione della NO sintetasi endoteliale nelle cellule geneticamente modificate per TRPM7. Uno degli eventi più precoci nell'aterogenesi è l'adesione dei monociti all'endotelio. Studieremo, pertanto, se diversi livelli di TRPM7 modulano l'interazione endotelio/monociti usando monociti marcati con il cromo e l'espressione di molecole di adesione via western blot. Dato che basso Mg extracellulare induce la sintesi di citochine proinfiammatorie, studieremo il profilo del network citochinico nelle cellule ingegnerizzate per TRPM7 mediante protein array. I risultati ottenuti saranno poi validati mediante western blot e/o ELISA.