ESPANSIONE DI CELLULE DI SANGUE CORDONE OMBELICALE UMANO POSITIVE PER IL FATTORE DI TRASCRIZIONE DI INSULINA (PDX-1 ).

PRESUPPOSTI Il sangue di cordone ombelicale umano contiene cellule staminali in grado di originare tutte le componenti cellulari mature del sangue , staminali mesenchimali ( che differenziano in osso, cartilagine, adipociti ) e staminali con un più ampio spettro di plasticità ( in grado di originare cellule epatiche , cellule muscolari e anche nervose). Durtante il processo proliferativo-differenziativo di queste tipologie cellulari intervengono fattori di trascrizione attivi nel reclutamento e nel mantenimento del programma di espressione di geni linea-specifici che non sono stati ancora del tutto indagati ma probabilmente essenziali per la qualità e la sequenza di espressione ( Pessina & Gribaldo , Curr Med Res Opin,2006). In precedenti esperimenti è stata anche evidenziata (nel sangue di cordone ombelicale) la presenza di cellule positive per nestina , citocheratina 8-18 e per fattori di trascrizione come Isl-1, Pax-4 e Ngn-3 importanti nella differenziazione pancreatica . Il fenotipo di queste cellule sembra compatibile con quello dei precursori di transizione in senso endocrino beta-cellulare ( Pessina et al. BBRC 323:315-322,2004). OBIETTIVI DELLA RICERCA Il nostro laboratorio ha individuato una condizione di coltura di cellule mononucleate isolate da sangue di cordone ombelicale che permette di espandere cellule CD45+ che risultano anche positive per CD105 ed esprimono il fattore di trascrizione dell¿insulina (PDX-1). La fase successiva dello studio si propone di: 1 Verificare il pattern di espressione genica per Synaptotagmina , Glut-2; Pax-4; Nkx6.1 e Ngn-3 di questa popolazione cellulare. 2 Condizionare il differenziamento di questa popolazione in senso beta-cellulare mediante stimolazione con betacellulina, activina-A e Glp1. 3 Valutare il ruolo modulante ( inibitore/stimolante ) di EGF nella differenziazione beta cellulare METODOLOGIE IMPIEGATE -Separazione su gradiente, di cellule mononucleate da sangue di cordone ombelicale -Clonaggio in mezzo semisolido ( metilcellullosa) ed espansione in colture liquide -Separazione delle popolazioni CD45+ e CD 105+ mediante magnetic beads column -RT-PCR e Wstern Blotting per studiare l¿espressione di mRNA e la produzione di proteine; -Immunocitochimica per identificare le popolazioni cellulari con fenotipo CD45+/PDX-1 +.