Studio dei meccanismi patogenetici della Sindrome da Ipoventilazione Centrale Congenita: effetti molecolari e cellulari delle mutazioni del fattore di trascrizione PHOX2B
Progetto La Sindrome da Ipoventilazione Congenita Centrale (CCHS=Congenital Central Hypoventilation Syndrome) è una malattia rara caratterizzata da gravi anomalie della respirazione che si manifestano prevalentemente durante il sonno e, nelle forme più severe, anche durante la veglia.
La fisiopatologia della malattia consiste in un difetto del Sistema Nervoso Autonomo nel generare appropriate risposte ventilatorie all'ipossia e all'ipercapnia determinato da un alterato sviluppo di una o più strutture neurali preposte a tali funzioni, con particolare riferimento al Nucleo Retro-Trapezoide e al Nucleo del Tratto Solitario. La mancata o ritardata diagnosi ha generalmente conseguenze devastanti che vanno dalla morte nella culla a gravissime lesioni neurologiche dovute ai numerosi episodi di ipossia cerebrale e di apnea; viceversa l'utilizzo precocissimo di supporti ventilatori può trasformarla in una malattia cronica compatibile con una qualità spesso buona della vita.
La CCHS riconosce cause genetiche, essendo una malattia autosomica dominante caratterizzata da mutazioni di PHOX2B, un fattore di trascrizione che svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo dell'intero Sistema Nervoso Autonomo, come documentato dal fenotipo dei topi KO e dai quadri clinici che accompagnano la malattia nell'uomo, dominati, oltre che dai sintomi respiratori , da vari altri segni di disfunzione autonomica come disturbi gastro-enterici, cardio-vascolari ed oculari.
Da un punto di vista genetico-molecolare, sono stati identificati due tipi diversi di mutazioni: espansioni di triplette di alanine e mutazioni tipo "frameshift".
Per entrambi non sono noti gli effetti a livello molecolare e cellulare che possano spiegare la patogenesi della malattia. Per quanto riguarda le espansioni di triplette, che costituiscono il 92% delle mutazioni osservate nella CCHS, una probabile ipotesi si basa sulla possibilità che l'allele mutato produca un prodotto proteico alterato capace di formare aggregati, i quali potrebbero esercitare un effetto tossico diretto e inoltre intrappolare la proteina normale causando un effetto dominante negativo. Per valutare questa ipotesi, intendiamo generare modelli di neuroblastomi ingegnerizzati con un sistema Tet/On in cui l'espressione di varianti mutate di PHOX2B sia inducibile dalla doxiciclina. Le forme mutate di PHOX2B conterranno una sequenza "tag" che ci consentirà di distinguerle dalla forma endogena. Mediante l'uso di anticorpi diretti contro il tag sarà possibile valutare per immunofluorescenza la formazione di aggregati in seguito ad esposizione delle cellule a doxiciclina, fornendo informazioni circa la loro localizzazione e le cinetiche di formazione ed eventuale dissoluzione dopo sospensione dell'induttore. Inoltre sarà possibile attraverso i comuni test di vitalità cellulare verificare se l'espressione delle forme mutate di PHOX2B eserciti un effetto tossico diretto sulle cellule nervose.