Valutazione del meccanismo molecolare del nitrossido come agente terapeutico nelle distrofie muscolari: studio del ruolo dei processi di fissione mitocondriale nel riparo tissutale.
Progetto Il nitrossido (NO) svolge un ruolo importante nel riparo muscolare dopo insulto chimico, meccanico od infiammatorio. Nella distrofia muscolare di Duchenne, malattia per la quale non vi è terapia risolutiva, parte del danno origina da una ridotta funzione della NO sintasi muscolare dovuta alla sua localizzazione ectopica per mancanza di un complesso distrofina-sarcoglicano corretto e funzionale. Ci siamo proposti di valutare un possibile ruolo terapeutico di NO e nel corso del precedente progetto FIRST abbiamo dimostrato che l'utilizzo di composti, i CINOD, che combinano proprietà antiinfiammatorie non steroidee con rilascio di NO, hanno forte e
persistente efficacia terapeutica. Abbiamo inoltre ottenuto in studi prliminari evidenza che la regolazione dei processi dinamici di fissione mitocondriale, e segnatamente della proteina fissogena DRP-1, da parte di NO correla con il suo effetto terapeutico.
OBIETTIVO: valutare le basi molecolari della azione terapeutica dei CINOD nella distrofia muscolare: in particolare comprendere se il ruolo terapeutico dell'NO da loro rilasciato sia mediato dal controllo della fissione mitocondriale.
DESCRIZIONE - i) valuteremo la capacità dei CINOD nitroparacetamolo e nitroibuprofene di promuovere il differenziamento di cellule satelliti e di stimolarne la funzione di riparo del tessuto muscolare. Utilizzeremo colture primarie di cellule satelliti di topo, capaci di generare muscolo scheletrico. Misureremo, dopo esposizione ai CINOD in vitro, markers biochimici del differenziamento, espressione di geni per microarray, attività ed espressione di DRP-1, la fissione ed il bilancio energetico mitocondriali. Il ruolo causale della fissione nella miogenesi e riparo muscolari saranno studiati utilizzando anche costrutti esprimenti forme cositutivamente attive e dominanti negative di DRP-1. Tratteremo topi knockout per alfa-sarcoglicano, un valido modello sperimentale di distrofia, con diete contenenti CINOD ed analizzeremo la loro efficacia terapeutica analizzando dopo trattamento l'aspetto istologico e lo stato funzionale del muscolo mediante immunoistochimica con marcanti appropriati, combinata con saggi di funzionalità in muscoli isolati. Si misurerà anche il recupero di funzionalità muscolare in vivo (attività creatin chinasica serica e saggi di resistenza allo sforzo). Valuteremo in parallelo il meccanismo della efficacia terapeutica dei CINOD misurando ex vivo in fettine di muscolo isolate da animali trattati la funzionalità mitocondriale, il bilancio energetico muscolare, il rapporto tra mitocondri fusi e fissi e la resistenza al danno citotossico. La comparazione dei dati ottenuti negli esperimenti ex vivo ed in vitro con il dato terapeutico in vivo ci permetterà di determinare i meccanismi molecolari alla base della efficacia terapeutica dei CINODs, in particolare il ruolo del controllo della fissione mitocondriale e del bilancio energetico muscolare.