RUOLO DELLE MODIFICAZIONI POST/CO-TRANSLAZIONALI DI AUTOANTIGENI MITOCONDRIALI NELLA CIRROSI BILIARE PRIMITIVA
Progetto PRESUPPOSTI DELLA RICERCA
La cirrosi biliare primitiva (CBP) è una malattia colestatica cronica a patogenesi autoimmune che colpisce prevalentemente il sesso femminile attraverso meccanismi ad oggi poco noti; ad oggi e' preferibile la definizione di colangite autoimmune in quanto un quadro di cirrosi e' raramente riscontrato, specialmente al momento della diagnosi. Dal punto di vista immunologico la malattia e' caratterizzata dalla presenza di autoanticorpi anti-mitocondrio (AMA) diretti contro autoantigeni mitocondriali come la subunita' E2 della piruvato deidrogenasi (PDH-E2). Ad oggi non e' noto come una reazione autoimmune che riconosca antigeni ubiquitari possa causare un danno tissutale specifico limitato alle vie biliari intraepatiche. E' interessante notare come nel caso della sclerosi multipla recenti dati sperimentali abbiano mostrato come modificazioni post-traslazionali del principale antigene mielinico possano essere responsabili di una maggiore sensibilita' dei sieri di soggetti affetti. Si ipotizza che una modificazione post-traslazionale non pertinente la sequenza aminoacidica determini l'antigenicita' della PDH-E2. Se verificata, questa ipotesi potrebbe permettere lo sviluppo di nuovi tools diagnostici e di nuove teorie patogenetiche.
SCOPO DELLO STUDIO
Scopi del presente studio sono (i) indurre la modificazione dell'epitopo della PDH-E2 mediante carboidrati che rappresentino le potenziali glicosilazioni post/co-translazionali; (ii) valutare la reattivita' di sieri di pazienti con CBP e AMA positivita' contro antigeni nativi e modificati
MATERIALI E METODI
Sintesi dei peptidi. Verranno sintetizzati 20 glicopeptidi derivanti dall'epitopo maggiore della PDH-E2 contenente aminoacidi potenzialmente modificabili (serina, treonina, asparagina) mediante l'aggiunta di mono- e disaccaridi. Nelle stesse molecole si produrranno peptidi con struttura a beta-turn o lineare al fine di determinare l'importanza dei diversi tipi di strutture terziarie. La sintesi verra' effettuata mediante una strategia SPPS a fase-solida Fmoc/tBu ed un approccio building-block con sintetizzatore automatico APEX.
Sieri. Verranno raccolti sieri di 80 pazienti con CBP (che includano 10 sieri AMA-negativi e di cui il 50% abbiano segni di cirrosi) e di una popolazione di controlli appaiati per sesso ed eta' che comprendono 40 pazienti con epatite cronica HCV- correlata (in stadio istologico appaiato ai casi di CBP), 40 pazienti con altre malattie autoimmuni e 40 soggetti sani. La positivita' degli AMA sierici verra' determinata in tutti i sieri con antigeni ricombinanti.
Screening dei sieri. Un sottogruppo di sieri (20 CBP, 20 controlli) verra' utilizzato per lo screening delle reattivita' contro i diversi peptidi sintetici mediante ELISA competitivo e non competitivo su fase solida. In seguito ai risultati dello screening si procedera' al test di tutti i sieri raccolti utilizzando i peptidi che presentino una reattivita' maggiore rispetto al peptide nativo.