Analisi del ruolo dell'esonucleasi EXO1 nell'attivazione dei meccanismi di salvaguardia del genoma

Tutte le cellule eucariotiche possono attivare specifici sistemi di riparazione per far fronte alle lesioni al DNA ma, se le lesioni ai cromosomi non vengono opportunamente riparate, possono essere attivati meccanismi che riarrangiano il genoma della cellula, portando anche a gravi alterazioni dell'integrità genomica e di conseguenza all'incapacità di coordinare in modo organizzato tutti gli eventi del ciclo cellulare, tra cui la replicazione del DNA, la coesione e segregazione dei cromosomi. E' ormai noto che l'alterazione di tali eventi è alla base dell'insorgenza del cancro nell'uomo. In tutte le cellule eucariotiche si sono evoluti specifici sistemi, chiamati checkpoint, per coordinare opportunamente tutti gli eventi del ciclo cellulare. Un ruolo centrale nel meccanismo di trasduzione del segnale di danno al DNA è giocato da molteplici proteine chinasi che si attivano in modo sequenziale, regolando poi molteplici effettori. Sebbene molti dettagli circa i meccanismi di trasduzione del segnale di danno al DNA siano stati chiariti, poco è noto circa i meccanismi che generano tale segnale. Dati ottenuti nel nostro laboratorio sia sul lievito Saccharomyces cerevisiae sia su cellule umane suggeriscono che il riconoscimento del danno da parte degli apparati di riparazione del DNA sia essenziale per la corretta attivazione dei meccanismi di salvaguardia del genoma. In particolar modo, in seguito a formazione di lesioni indotte dai raggi UV (dimeri di pirimidine, 6-4 foto-prodotti), è di fondamentale importanza il processamento di tali lesioni da parte del meccanismo di riparazione per escissione di nucleotidi (nucleotide excision repair, NER) per attivare i checkpoint in fase G1 e G2/M del ciclo cellulare. Studi sul lievito Saccharomyces cerevisiae suggeriscono, inoltre, che, in seguito al processamento di alcune lesioni da parte del NER, sia fondamentale l'azione di una esonucleasi, EXO1, per l'attivazione dei meccanismi di checkpoint. Lo scopo del progetto di ricerca è di comprendere la funzione della esonucleasi EXO1 nelle cellule umane. Ci proponiamo di comprendere se EXO1 interagisce con le proteine coinvolte nel NER e i dettagli molecolari di un suo possibile ruolo nel mantenimento della stabilità del genoma. In particolare, ci proponiamo di: 1) studiare la localizzazione cellulare di EXO1 in seguito ad irraggiamento con raggi UV; 2) analizzare tramite immuno-precipitazione possibili interazioni fisiche tra EXO1 e le proteine del NER; 3) ridurre l'espressione del gene EXO1 tramite interferenza con piccoli RNA e monitorare se l'assenza di EXO1 provoca mancata attivazione dei checkpoint. Un difetto nell'attivazione dei checkpoint verrà valutato sia tramite immuno-fluorescenza sia tramite immuno-blot. I risultati attesi potrebbero contribuire nel breve termine alla comprensione dei circuiti regolativi tra i controlli del ciclo cellulare e la riposta a danni al DNA.