Sviluppo di un nuovo test sierologico ELISA per la diagnosi della cirrosi biliare primitiva
Progetto PRESUPPOSTI
La cirrosi biliare primaria (CBP) è una patologia epatica cronica ad eziologia autoimmune. La CBP è caratterizzata dalla presenza di anticorpi anti-mitocondriali (AMA) nel 90-95% dei pazienti. I principali autoantigeni bersaglio degli AMA sono le sottounità E2 del complesso della piruvato deidrogenasi (PDC-E2), il complesso dell'acido 2-oxodeidrogenasi (BCOADC-E2) a catena ramificata e il complesso 2-oxo-glutarato deidrogenasi (OGDC-E2). Gershwin e collaboratori hanno creato un'unica proteina ricombinante (definita MIT3) contenente gli epitopi immunodominanti di queste tre sottounità, dimostrando una maggiore sensibilità e specificità dei tests sierologici (ELISA, immunoblotting, etc) basati su questo ricombinante rispetto ai tests basati sugli antigeni individuali. Oltre agli AMA, circa un terzo dei pazienti affetti da CBP presenta anticorpi antinucleari (ANA), soprattutto con pattern 'rim-like' all'immunofluorescenza indiretta (IIF) (autoantigene principale la proteina gp210) e pattern 'multiple nuclear dots' (autoantigene principale la proteina sp100). Gli anti-gp210 e anti-sp100 sono presenti in circa il 30% dei pazienti affetti da CBP e sono altamente specifici per la malattia. Inoltre, essendo questi anticorpi presenti nel 10-50% dei pazienti affetti da CBP ma negativi per gli AMA, cioè il principale marcatore diagnostico della malattia, rappresentano un importante ausilio diagnostico per la malattia. Ad oggi, l'IIF rappresenta il metodo più usato per lo screening sierologico in casi di sospetta CBP, anche se tale metodica è gravata da scarsa sensibilià e specificità. Lo sviluppo di tests sierologici più sensibili, sensibili, accurati, e meno costosi (i.e., ELISA) permetterà una migliore gestione clinica dei pazienti con CBP, oltre alla possibilità di sviluppare programmi di screening per soggetti ad elevato rischio di malattia, quali i famigliari consanguinei.
OBIETTIVO
Valutare la sensibilità e specificità di un test ELISA basato su una proteina ricombinante che esprime contemporaneamente gli epitopi immunodominanti dei tre principali antigeni mitocondriali (MIT3) e nucleari (gp210 e sp100)
MATERIALI E METODI
Verranno studiati i sieri di 200 pazienti affetti da CBP, 50 di colangite sclerosante primitiva, 50 di epatite autoimmune, 100 sieri di soggetti sani appaiati per sesso ed età ai pazienti con CBP.
Ciascun siero verrà testato mediante:
(1) ELISA basato su una nuova proteina ricombinante che esprime contemporaneamente gli epitopi immunodominanti degli antigeni mitocondriali (MIT3) e nucleari (gp210 e sp100). Tale proteina ricombinante è stata sviluppata nei laboratori di R&D di INOVA Diagnostics (San Diego, CA).
(2) ELISA basati sui 3 autoantigeni individuali (INOVA Diagnostics).
(3) IIF su linea cellulare Hep2 e sezioni tessutali di fegato-stomaco rene.
Il valore soglia per definire la positività di ciascun ELISA verrà identificato mediante analisi delle curve ROC (Stata Corporation, College Station, TX).