Verifica dell' Esistenza di un Pathway cAMP-Epac-Rap1-VE-caderina mediato nella Dinamicità giunzionale che Regola una corretta Spermatogenesi
Progetto L'infertilità maschile umana colpisce il 10-12% delle coppie e costituisce un problema sociale che i trattamenti per l'infertilità non risolvono del tutto. Il modello animale progettato e generato nel nostro laboratorio (Aivatiadou et al., 2007) ha permesso di stabilire che la GTPasi Rap1 è essenziale per una corretta spermiogenesi in quanto il suo malfunzionamento porta ad infertilità maschile dovuta a rilascio prematuro dall'epitelio seminifero di spermatidi immaturi, cioè non differenziati in spermatozoi fertili. Questo fenotipo è risultato essere dovuto alla destabilizzazione delle giunzioni aderenti note come 'ES' ('Ectoplasmic Specializations') che si instaurano tra cellule germinali in differenziamento e cellule del Sertoli, le somatiche di supporto. Rap1 in cellule somatiche è nota regolare l'adesione cellulare mediata sia da Integrine sia da caderine. Ciò su cui proponiamo di indagare è: i) identificare le molecole di adesione coinvolte nelle ES; ii) delineare il pathway attraverso cui Rap1 agisce sulle molecole di adesione per permettere la stabilità e dinamicità giunzionale. Abbiamo già avuto indicazioni che un componente delle ES è la VE-caderina, molecola di adesione già riportata in letteratura essere target di Rap1 a livello della barriera endoteliale. Verificheremo pertanto tramite una analisi dettagliata ed estensiva sia di immunoistochimica sia di immunofluorescenza il pattern di distribuzione di VE-caderina in sezioni di testicolo di topi wild-type per stabilire quali sono le cellule coinvolte nelle ES (16 tipi diversi di spermatidi dagli 'early round' ai 'late eleongated'). L' immunostaining x VE-caderina (anticorpi commerciali) sarà abbinato alla colorazione con ematossilina (IH) e DAPI (IF) per poter stabilire il tipo di spermatidio coinvolto nella adesione, mediante analisi del livello di condensazione della cromatina/presenza chromatoid body. Una volta stabilito il pattern di VE-caderina nel wild-type, saranno condotte analisi parallele su sezioni di testicolo di topi transgenici Rap1-mutati. Per le successive doppie-immunolocalizzazionì Rap1/VE-caderina su sezioni sia di wild-type sia di transgenico, utilizzeremo la microscopia confocale a scansione laser. Inoltre ci appresteremo ad utilizzare la tecnica delle criosezioni, per ottenere dati sempre più attendibili e definitivi. Circa il pathway di attivazione di Rap1, focalizzeremo l' attenzione sul suo GEF, attivato direttamente da cAMP, noto come Epac. Rap1, nel controllo funzionale della barriera endoteliale, è attivata tramite Epac. Pertanto verificheremo la presenza di Epac nelle cellule germinali mediante sia RT-PCR sia Western blotting. Utilizzeremo analoghi non idrolizzabili cel cAMP per stimolare Epac nelle cellule spermatogeniche isolate e mantenute in coltura, per verificare sia l' attivazione di Rap1 endogeno sia la sua redistribuzione in cellula con particolare riguardo a siti subplasmalemmali.