Generazione ed isolamento di cellule pacemaker derivate da cellule embrionali staminali geneticamente modificate per esprimere stabilmente il gene TBX3.

I disturbi del ritmo cardiaco (es. aritmie e blocco di conduzione) sono patologie molto diffuse, dovute sia a fattori genetici che a fattori acquisiti. Queste disfunzioni del ritmo spesso richiedono l¿impianto di un pacemaker elettronico come unica terapia possibile. Negli ultimi anni la ricerca scientifica si è concentrata sulla possibilità di generare un pacemaker biologico, cioè un substrato cellulare autoritmico con caratteristiche elettriche simili al tessuto pacemaker naturale che possa sostituire il pacemaker elettronico. L¿uso di cellule staminali costituisce un interessante strategia in questo campo e le cellule embrionali staminali (ESC) potrebbero rappresentare il substrato ideale data la loro capacità di differenziarsi , in opportune condizioni di coltura, in tutti i tipi di cellule cardiache (Hescheler et al. 1997). Risultati recenti del nostro gruppo hanno dimostrato la possibilità di ottenere cellule con caratteristiche simili alle cellule pacemaker native, a partire da ESC di topo.Tuttavia, le procedure di differenziamento non permettono di ottenere una popolazioni pura e con rese sufficientemente elevate da ipotizzare una applicazione terapeutica. Questo progetto si propone di modificare geneticamente le ESC al fine di migliorare la resa quantitativa di cellule autoritmiche e di isolare una popolazione con caratteristiche elettriche/molecolari omogenee. La strategia che intendiamo adottare consiste nell¿indurre l¿ espressione costitutiva del gene TBX3 nelle ESC indifferenziate. È infatti noto dalla letteratura che la proteina Tbx3 è espressa in modo specifico nel tessuto pacemaker cardiaco e reprime l¿attivazione del programma genico di differenziamento verso un fenotipo atriale e ventricolare (Hoogaars et al. 2004). Per visualizzare ed isolare le cellule di interesse, le ESC wt e quelle che esprimono stabilmente il Tbx3 verranno modificate in modo da esprimere un gene reporter (DsRed) sotto il promotore del gene HCN4, marcatore specifico delle cellule pacemaker senoatriali. I costrutti plasmidici contenenti, oltre al gene/promotore di interesse, anche il gene per la resistenza all¿antibiotico igromicina varranno introdotti nelle cellule ES tramite nucleofezione. I cloni che integreranno i costrutti nel loro genoma verranno selezionati coltivando le cellule in presenza di elevate concentrazioni (200 ¿g/ml) di igromicina. Una volta ottenuti i cloni stabili, le ESC wt e le ESC-Tbx3 verranno differenziate verso un fenotipo cardiaco attraverso la tecnica delle ¿hanging drops¿ e la formazione di ¿embryoid bodies¿. L¿analisi al FACS (fluorescence-activated cell sorting) delle cellule DsRed-positive permetterà sia di valutare il numero di cellule pacemaker che di separarle in modo da ottenere una popolazione omogenea. La caratterizzazione molecolare e funzionale delle cellule isolate verrà eseguita mediante analisi elettrofisiologiche (patch-clamp) e di immunofluorescenza (analisi confocale).