Analisi funzionale di geni coinvolti nel programma di ematopoiesi/vasculogenesi durante lo sviluppo embrionale di Zebrafish (Danio rerio).
Progetto Nei mammiferi l¿ematopoiesi rappresenta un processo differenziativo in cui tutti gli elementi funzionali del sangue si formano a partire da una singola cellula staminale ematopoietica (HSC). La via di segnalazione di Notch che potrebbe essere coinvolta nel mantenimento e nel differenziamento delle HSCs è influenzata da proteine regolatrici extracellulari, citoplasmatiche e nucleari, tra le quali la proteina Numb (Allman et al., Imm. Reviews 187, 75-86, 2002). Mediante clonaggio ¿in silico¿, sulla base della sequenza delle proteine umane NUMB abbiamo identificato un solo clone EST lungo 2652 bp, codificante per una putativa proteina di 618 aa che all¿N-terminale contiene tutti i residui chiave tipici di un dominio PTB e condivide caratteristiche sia con la proteina NUMB umana che con il suo omologo NUMBLIKE. L¿analisi dell¿espressione spaziale del gene z-numb mediante ibridazione in situ, ha evidenziato che numb in zebrafish è espresso in modo simile a quello dell¿embrione di mammifero. Il normale pattern di espressione di z-numb verrà modificato mediante esperimenti di microiniezione allo stadio di 1-2 cellule allo scopo di bloccare in modo specifico il trascritto di z-numb. Questo obiettivo non sarà particolarmente difficile da raggiungere in zebrafish, poiché il rapido sviluppo esterno degli embrioni e la loro trasparenza consentono una agevole osservazione dei processi di sviluppo e dei fenotipi mutanti. Disponiamo già di un oligonucleotide antisenso, morfolino, numb-MO (GeneTools, LLC) in grado di bloccare in modo specifico la traduzione di numb in embrioni di zebrafish. L¿effetto sull¿embrione è dose-dipendente: possono essere ottenute fenocopie di mutazioni con penetranza crescente aumentando la quantità di oligonucleotide iniettata. Verranno iniettate dosi differenti (0.5¿2 pmoli) di numb-MO e GFP o destrano rodaminato saranno coiniettati negli embrioni allo stadio di 1¿2 cellule. Abbiamo già allestito esperimenti guida e un¿analisi preliminare degli embrioni iniettati ci ha permesso di evidenziare una serie modulata di fenotipi in cui la circolazione sanguigna risulta compromessa. La colorazione con o-dianisidina di embrioni in toto iniettati, ha rivelato una drastica riduzione del numero di cellule del sangue circolanti, che risultano confinate nella regione del sacco del tuorlo. Per identificare alterazioni delle cellule in differenziamento e delle strutture in via di sviluppo gli embrioni iniettati saranno analizzati mediante ibridazione in situ utilizzando marcatori molecolari già disponibili presso il nostro laboratorio, quali fli1 (un marcatore precoce della formazione dell¿emangioblasto), lmo2 (espresso nell¿endotelio precoce e nei progenitori delle cellule del sangue), gata2 (espresso nelle HSCs), gata1 (marcatore delle cellule eritroidi e mieloidi), ikaros (marcatore dei progenitori linfoidi) e altri, per analizzare in dettaglio il processo di ematopoiesi.