Studio comparativo sull'impiego di una PCR tradizionale e due diverse Real-time PCR nella diagnosi e nel monitoraggio della Leishmaniosi viscerale
Progetto Background: La leishmaniosi viscerale (LV) è una patologia endemica in 88 paesi (inclusa l¿Italia) considerata emergente soprattutto nei soggetti immunocompromessi (con infezione da HIV; trapiantati di organo solido). Per questi ultimi la diagnosi clinica e microbiologica è gravata da notevoli difficoltà (overlapping con altre sindromi febbrili; scarsa sensibilità delle metodiche tradizionali). La reazione polimerasica a catena (PCR) è stata sino ad ora impiegata per la diagnosi di LV in una trentina di lavori mentre le esperienze con la Real-time sono limitate . Non vi sono in letteratura studi comparativi che abbiano valutato l¿impiego delle due metodiche.
Obiettivo dello studio: lo scopo del presente studio è quello di verificare in maniera comparativa quale sia la metodica molecolare migliore per la diagnosi e il monitoraggio (durante e dopo la terapia) della LV. Per quanto riguarda le metodiche molecolari impiegheremo una PCR tradizionale basata sull¿utilizzo di primers (R223 e R333) che amplificano una regione di 359 bp del gene che codifica per la piccola subunità ribosomiale (ssuRNA) di Leishmania. La Real-time verrà effettuata amplificando il gene a-polimerasi che è un gene a singola copia sufficientemente conservato da consentire l¿impiego di una coppia di primers e una sonda in grado di riconoscere con la stessa efficienza tutte le leishmanie patogene per l¿uomo. La seconda metodica di PCR verrà effettuata amplificando una regione del DNA del chinetoplasto con i primers RV1 e RV2 precedentemente descritti 1.La popolazione studiata comprenderà soggetti immunocompetenti (sia adulti sia bambini) e immunocompromessi con infezione da HIV. Le tre metodiche verranno valutate per l¿efficienza nella diagnosi primaria di LV e per la capacità di quantificazione della carica parassitaria (semiquantitativa per la PCR tradizionale; quantitativa per la Real-time). I materiali biologici che verranno saggiati saranno campioni di sangue periferico raccolti seriatamente e aspirato midollare (alla diagnosi ed eventualmente nel follow-up).
Risultati attesi: Da molti anni presso il nostro laboratorio viene impiegata una metodica di PCR semiquantitativa per la diagnosi e il monitoraggio della LV. Si vuole verificare se l¿utilizzo di una metodica di Real-time possa costituire un reale vantaggio nella pratica clinica nella gestione di questi pazienti; inoltre si vuole verificare quale tra le due metodiche di Real-time (amplificazione del chinetoplasto o del gene a-polimerasi) costituisca la migliore in termini di sensibilità e specificità.
1. Lachaud L, et al. Value of two PCR methods for the diagnosis of visceral leishmaniasis and the detection of asymptomatic carriers. Parasitology 2002; 125: 197-207.