Coniugazione con polietilenglicole (PEG) per la stabilizzazione nel circolo della chemochina epiteliale mucosa-associata CCL28
Progetto Introduzione. La migrazione delle plasmacellule secernenti IgA è correlata alla presenza di chemochine ed alla espressione di loro specifici recettori. La chemochina epiteliale mucosa-associata, nota come CCL28, ha la caratteristica di stimolare in modo specifico la secrezione di immunoglobuline IgA-ASC, che derivano sia dai diversi organi linfoidi mucosali sia dai tessuti intestinali ed extraintestinali, quali ghiandole mammarie e salivari. Le concentrazioni di CCL28 vaginale, salivare, e nel latte, e quelle mucosali di IgA HIV-specifiche, sono significativamente elevate in individui esposti al virus HIV. CCL28 mostra una potente attività contro i microorganismi Gram-positivi e Gram-negativi, che ne renderebbe interessante l¿utilizzo farmacologico. L¿attività nel circolo di proteine è limitata dalla breve emivita dovuta alla filtrazione renale, se di peso molecolare (pm) <65 kDa, ed alla degradazione proteolitica nell¿endotelio in seguito alla fuoriuscita dai vasi. Il prolungamento dell¿emivita è stato ottenuto con la coniugazione al Polietilen glicole (PEG), polimero con bassa attività antigienica. Sono note diverse strategie di coniugazione, che il nostro laboratorio ha utilizzato per la stabilizzazione di emoglobina umana in un progetto europeo STREP (Eurobloodsubstitutes) sui trasportatori dell¿ossigeno a base emoglobinica e per la stabilizzazione di una immunoglobulina in collaborazione con un¿azienda italiana del settore. La presente richiesta intende applicare l¿esperienza acquisita alla stabilizzazione di CCL28. Per il progetto ci si avvarrà della collaborazione della Cattedra di immunologia della Facoltà di Medicina e Chirurgia (Prof. Mario Clerici) per la fornitura di proteina ricombinante e per i test biologici sull¿attività dei prodotti di pegilazione e della collaborazione del Dr. Simone Cristoni per le analisi di spettrometria di massa da eseguire presso il CISI dell¿Università di Milano.
Metodi ed obbiettivi specifici. CCL28 è un omodimero formato dall¿associazione di due polipeptidi di 12 kDa. La coniugazione con PEG di 6 kDa può aumentare il pm apparente ed il raggio idrodinamico, fino ad impedire la filtrazione renale e rallentare la fuoriuscita dai vasi. Ad es., l¿aumento del pm dell¿emoglobina da 65 a 100 kDa, con 5-6 catene di PEG dà un pm apparente di 350-400 kDa e raddoppia il raggio idrodinamico. La coniugazione avviene in due stadi: 1) si modificano gli ammino gruppi della proteina con 2-iminotiolano (IMT) che introduce un braccio terminante con un gruppo SH; 2) il gruppo SH reagisce con PEG funzionalizzato con maleimmide (MAL-PEG). Per identificare i gruppi amminici modificati da IMT si fanno reagire gli SH con N-etilmaleimide (NEM), si digerisce la proteina con proteasi e si analizzano i peptidi mediante spettrometria di massa. Dopo aver determinato le condizioni ottimali per la modifica con IMT e NEM si procede alla preparazione dei prodotti di pegilazione ed allo studio della loro attività biologica.