Effetto del controllo dell'espressione dell'enzima GM3 sintasi sulla invasività di cellule di carcinoma ovarico umano in coltura

Presupposti: il ganglioside GM3 complessato con i recettori integrinici controlla la motilità e l¿invasività di cellule di carcinoma della vescica, regolando lo stato di attivazione di c-Src. c-Src è attivato in cellule con bassi livelli di GM3 ed alto potenziale invasivo, mentre varianti con alti livelli di GM3 hanno ridotta attivazione di Src e ridotta motilità. D¿altra parte la proteina di membrana caveolina-1 inibisce lo sviluppo di metastasi nel carcinoma mammario e promuove l¿adesione intercellulare con un meccanismo che coinvolge l¿inibizione di c-Src. Noi abbiamo dimostrato che cellule di carcinoma ovarico con un fenotipo resistente esprimono livelli di gangliosidi e di caveolina-1 più elevati rispetto alle cellule sensibili di confronto. Le cellule con alti livelli di gangliosidi e caveolina-1 risultano meno invasive delle cellule sensibili. Descrizione della ricerca: Utilizzeremo le linee di carcinoma ovarico umano A2780 e A2780/HPR, nelle quali il metabolismo degli sfingolipidi è stato studiato in dettaglio nei nostri laboratori. Il cDNA per la GM3 sintasi umana è stato ottenuto dalla banca di cDNA umani. La full-length open reading frame del gene verrà amplificata per PCR con primers che consentano l¿introduzione di siti di restrizione per specifiche endonucleasi. I prodotti di PCR verranno clonati in un vettore di espressione plasmidico. Le cellule A2780 verranno transfettate con i plasmidi utilizzando lipidi cationici. Le colture transfettate verranno coltivate in presenza dell¿antibiotico appropriato per ottenere la selezione di cloni stabili. I livelli di mRNA dell¿enzima overespresso verranno valutati per real-time PCR e la attività enzimatica verrà valutata mediante dosaggi in vitro sul substrato naturale radiomarcato. L¿effetto della overespressione della GM3 sintasi sui livelli cellulari di caveolina-1 verrà valutato mediante PCR e western blotting. L¿effetto della overespressione della GM3 sintasi sulla motilità ed invasività cellulare verrà valutato in vitro mediante wound healing assay o test di invasione in Matrigel in condizioni basali o in presenza di vari ligandi dei recettori integrinici. Obiettivi: Questo studio si propone di valutare l¿ effetto del controllo dell¿espressione dell¿enzima GM3 sintasi sulla invasività di cellule di carcinoma ovarico.