Metodologie bioanalitiche per la valutazione dell'attività antiossidante e della modulazione della sintesi di ossido di azoto di estratti vegetali e/o loro principi attivi

E¿ stato dimostrato che il trattamento con fitoestrogeni (soia) è in grado di indurre sia nell¿uomo che in modelli animali un effetto di vasodilatazione, o attraverso stimolazione diretta delle NOS, e/o modulazione della loro espressione genica, e/o aumentata biodisponibilità dell¿ossido di azoto (NO) e dei suoi metaboliti (effetto di risparmio). Nell¿ambito delle nostre competenze sull¿attività antiossidante di prodotti di origine naturale e di quelle sviluppate per la definizione del destino metabolico dell¿NO, come prosecuzione degli studi già intrapresi, si intende svolgere uno studio al fine di chiarire con quale meccanismo i fitoestrogeni della soia (genisteina, daidzeina) siano in grado di intervenire nell¿incrementare i livelli basali di ossido d¿azoto e suoi metaboliti. Studi effettuati in precedenza ci hanno consentito di mettere a punto una metodologia chemiluminometrica altamente specifica e sensibile, per la definizione del profilo metabolico dell¿NO in sistemi cellulari. In particolare, mediante l¿applicazione di questa metodologia, lo studio verrà articolato nelle seguenti fasi: 1) valutazione dell¿entità e cinetica di produzione di NO in cellule endoteliali ed epiteliali in presenza di concentrazioni crescenti di genisteina, daidzeina ed estratti di soia da noi opportunamente standardizzati mediante tecniche LC-MS; 2) in caso di evidenze positive, screening dell¿attività NO-sintasi stimolante di analoghi strutturali della genisteina, quali i suoi metaboliti equolo e daidzeina, ed i suoi precursori glicosidati (genistina); 3) razionalizzazione, su basi molecolari, dell¿attività NO-modulante, attraverso studi sulle relazioni struttura-attività (SAR) e l¿applicazione concertata di tecniche computazionali quali docking (a livello del sito attivo e allosterico dell¿enzima) e di dinamica molecolare. In parallelo, verrà valutata la capacità dei singoli composti e degli estratti di indurre a livello cellulare l¿espressione dei geni delle NOS, mediante tecniche SDS-PAGE e Western blot con anticorpi anti-NOS. Inoltre, dal momento che l¿aumentata biodisponibilità dell¿NO può essere legata ad un effetto risparmio dovuto alla capacità antiossidante delle molecole, di ogni singolo derivato verranno valutate: a) l¿attività antiossidante (prototipo anione superossido), attraverso l¿impiego di metodologie analitiche diversificate e di modelli in fase omogenea e cellulare; b) l'effetto citotossico a livello nucleare (frammentazione del DNA, COMET assay). Per lo studio si procederà, come già svolto in precedenti ricerche, ad una valutazione per gradi di complessità, utilizzando inizialmente modelli cell-free (ORAC, DPPH, ABTS, FRAP), quindi modelli di membrana artificiali e non (liposomi di fosfatidilcolina, micelle di acidi grassi poliinsaturi, frazioni microsomiali epatiche di ratto), sistemi cellulari (colture primarie e secondarie di cheratinociti e cellule endoteliali, eritrociti) e infine plasma (ratto, uomo).