Il trapianto nucleare nel bovino quale modello per lo studio del trasferimento di ooplasma nel trattamento di correzione dei danni da senescenza fisiologici o patologici dell¿ovocita
Progetto La tecnica di trasferimento della vescicola germinale (GVT) consiste nel trasferire il nucleo (carioplasto) di un ovocita immaturo in un altro precedentemente enucleato (citoplasto). Nell¿ambito della tecnologie applicate alla riproduzione medicalmente assistita nella specie umana, tale tecnica è stata proposta per interventi di donazione dell¿ooplasma al fine di correggere i danni conseguenti alla senescenza naturale o prematura dell¿ovocita, come le mutazioni del DNA mitocondriale (Spikinkgs et al., 2006 Hum Reprod Update 12:401-415). Tuttavia, il problema maggiore del GVT è rappresentato dall¿eteroplasmia dovuta al trasferimento di mitocondri difettivi insieme al carioplasto, in misura maggiore del 5% (Liu et al., 2004 Biol Reprod 71:1724-1729). Per ridurre tale eventualità si potrebbe intervenire con la centrifugazione dell¿ovocita o la riduzione delle dimensioni del carioplasto prima del trapianto nucleare, anche se recenti lavori indicano che è necessario mantenere un diametro minimo del carioplasto affinchè l¿ovocita ricostruito possa riprendere il processo di divisione meiotica. Tuttavia, prima che tale tecnica possa essere proposta in ambito terapeutico umano si rende necessario un adeguato periodo di sperimentazione nelle specie di laboratorio e domestiche. A tal fine, il bovino rappresenta un valido modello sperimentale sia per l¿ampia conoscenza delle tecnologie di riproduzione assistita (ART) in questa specie, sia per la facile reperibilità del materiale biologico in sede di macellazione.
In questa ricerca ci proponiamo quindi di verificare se con tecniche di centrifugazione e con la progressiva riduzione delle dimensioni del carioplasto sia possibile ridurre il rischio di eteroplasmia mitocondriale in seguito a GVT. A tal fine verranno allestiti 5 esperimenti separati dove gli ovociti verranno trattati come precedentemente indicato (Luciano et al., 2006 Repr Fert Dev 18:138). Brevemente, i gameti saranno sottoposti a centrifugazione e la GV verrà rimossa con una quantità di citoplasma variabile. I carioplasti così ottenuti verranno misurati e successivamente sottoposti a colorazione vitale per la determinazione della presenza di mitocondri (Liu et al., 2004 Biol Reprod 71:1724-1729). In seguito i carioplasti verranno trasferiti nello spazio perivitellino di un citoplasto eterologo, ricostruiti mediante elettrofusione e sottoposti a maturazione in vitro (Luciano et al., Mol Reprod Dev 2005:71 389-97). Al termine della coltura, verrà valutata la capacità di completare la divisione meiotica e gli ovociti con un globulo polare visibile (Metafase II) saranno sottoposti ad attivazione partenogenetica per valutare la capacità di sviluppo embrionale.
I risultati di questo studio potranno contribuire sia alla ricerca di base, sia a rendere ripetibile ed affidabile la donazione di ooplasma nella riproduzione medicalmente assistita nella specie umana.