CELLULE STAMINALI DA CORDONE OMBELICALE NELLA SPECIE EQUINA: ISOLAMENTO, CARATTERIZZAZIONE E COLTURA IN VITRO SU MATRICE NANOFIBRILLARE SINTETICA
Progetto Obiettivo del progetto è la messa a punto di protocolli per l¿isolamento, lo sviluppo e la caratterizzazione molecolare di cellule staminali ottenute da differenti componenti del cordone ombelicale di puledri da utilizzare in medicina veterinaria per costituire una banca di staminali mesenchimali da impiegare per possibili e promettenti applicazioni terapeutiche nella riparazione tissutale.
Le cellule mesenchimali isolate da differenti componenti del cordone ombelicale di puledri alla nascita (gelatina di Warthon, parete dei vasi, sangue refluo cordonale, amnios e liquido amniotico) saranno coltivate su un particolare supporto nanofibrillare denominato Ultra-Web Synthetic ECM®, una matrice extra cellulare sintetica, reperibile in commercio. Questo supporto è costituito da una matrice nanoporosa e nanofibrillare tridimensionale prodotta depositando nanofibre di poliamide (del diametro di circa un nanometro) su un vetrino coprioggetto con tecnica di flusso ad alta pressione in un elevato campo elettrico. Il supporto di poliamide così strutturato ricrea in vitro la struttura tridimensionale della matrice extracellulare/membrana basale. Le cellule mesenchimali saranno seminate ad una concentrazione 105 cellule/ml (0.5 ml/pozzetto) in piastre petri contenenti il supporto nanofibrillare o senza supporto come controllo impiegando come terreno di coltura il Dulbecco¿s Modified Eagle¿s Medium (DMEM) contenente siero fetale di vitello al 20%, antibiotici (200 U/ml penicillina, 200 g/ml streptomicina) ed incubate a 37° C in atmosfera umidificata con CO2 al 5%. La crescita cellulare verrà controllata ogni 24 ore e la vitalità cellulare determinata mediante test MTT. Impiegando la valutazione dell¿espressione di Nanog e Oct4, proteine marker del mantenimento della pluripotenza cellulare, verrà controllato il grado di mantenimento dello sdifferenziamento cellulare nelle mesenchimali coltivate su matrice nanoporosa-nanofibrillare ed in quelle di controllo coltivate in piastre Petri per colture cellulari. I risultati attesi dalle sperimentazioni riguarderanno: individuazione delle strutture del cordone ombelicale più adatte come fonte di staminali, banca di cellule staminali equine da cordone ombelicale, protocolli sperimentali per la produzione in vitro di cellule staminali adulte mediante nanofibrille, messa a punto di test diagnostici molecolari specifici della specie equina per la caratterizzazione di cellule staminali.