LOCALIZZAZIONE CELLULARE E SUBCELLULARE DEL RECETTORE GABA-B DURANTE LA DIFFERENZIAZIONE DELLE CELLULE DI SCHWANN DEL SISTEMA NERVOSO PERIFERICO
Progetto E¿ ormai noto che a livello del sistema nervoso periferico (SNP), il GABA e i suoi recettori, sia di tipo A (GABA-A) che di tipo B (GABA-B), controllano alcuni parametri biochimici e morfologici, sia del compartimento mielinico che di quello assonale Recentemente abbiamo considerato soprattutto il possibile ruolo esercitato dai recettori GABA-B nel controllo della biologia delle cellule di Schwann. Questo allo scopo di identificare nuove possibili strategie terapeutiche per alcune condizioni fisiopatologiche in cui il SNP viene compromesso, come ad esempio le patologie demielinizzanti, i traumi dei nervi o le neuropatie ereditarie come la malattia di Charcot-Marie-Tooth. Le ricerche finanziate dal FIRST fra il 2003 e il 2006, ci hanno permesso di dimostrare la presenza funzionale dei recettori GABA-B nelle cellule di Schwann. In queste cellule tali recettori mediano la proliferazione, nonché l¿espressione di alcune proteine fondamentali per il processo di mielinizzazione. I risultati ottenuti dagli studi successivi sui topi knock-out per il recettore GABA-B, sono in accordo con gli studi precedenti. Infatti la carenza del recettore GABA-B è in grado di indurre delle modificazioni biochimiche (aumento di espressione delle proteine mieliniche) e morfologiche (riduzione del diametro assonale e dello spessore mielinico) a livello dei nervi periferici. Nel complesso, tali osservazioni dimostrano che il sistema GABAergico partecipa al controllo del processo di mielinizzazione del SNP.
Obiettivo - Dal punto di vista molecolare il controllo GABA-B-mediato della proliferazione delle cellule di Schwann è conseguente ad un aumento dei livelli del secondo messaggero intracellulare cAMP. E¿ noto, inoltre, che i livelli di cAMP sono fondamentali per controllare la proliferazione e la differenziazione delle cellule di Schwann, inducendo dei cambi di distribuzione delle fibre intracellulari di actina filamentosa.
In questo progetto, mediante la tecnica di immunocitochimica in microscopia confocale verrà ulteriormente analizzata la presenza nelle membrane delle cellule di Schwann del complesso recettoriale GABA-B, valutando la possibile colocalizzazione con le fibre di actina filamentosa. Verrà poi analizzata la possibile diversa localizzazione subcellulare del recettore GABA-B in funzione della differenziazione delle cellule di Schwann indotta da forscolina, un agente capace di indurre un aumento di cAMP.
Metodologia - Verranno utilizzate colture di cellule di Schwann da ratti neonati al 3°-4° PND. Le cellule verranno trattate con concentrazioni diverse di forscolina: 2microM (condizione basale indifferenziata) e 10 microM per indurle a differenziarsi. Sulle cellule verrà eseguita una analisi ICC in doppia marcatura con un Ab anti-GABA-B e un Ab anti-falloidina, allo scopo di marcare i filamenti di actina che determinano il citoscheletro delle cellule di Schwann. Infine sui preparati verrà eseguita un'analisi di immagine al microscopio confocale.