Modulazione dell¿interazione tra trasportatore del glutammato EAAC1 e proteine PDZ in epiteli e neuroni.

I trasportatori del glutammato mediano la ricaptazione del neurotrasmettitore a livello della sinapsi, giocando così un ruolo essenziale nel controllo della durata dell¿evento sinaptico e prevenendo danni eccitotossici. Sono anche espressi in epiteli assorbenti quali rene e intestino dove mediano l'assorbimento di amino acidi acidi. Studi condotti negli ultimi anni hanno messo in evidenza come la loro attività ed espressione in superficie sia finemente modulata dall'interazione con proteine ad essi associate. In particolare, abbiamo recentemente visto che il dominio carbossi terminale di EAAC1 interagisce con proteine PDZ e tale interazione controlla l¿espressione del trasportatore sulla superficie cellulare (lavoro sottomesso). Abbiamo clonato alcune delle proteine PDZ, espresse nella superficie apicale di cellule MDCK e in neuroni, e potenzialmente interagenti con EAAC1. Obiettivo della ricerca proposta sarà verificare se tali interazioni: 1) avvengano realmente in vivo. 2) siano modulate dall¿attivazione di vie di traduzione del segnale. 1) verificare se le interazioni trasportatore-proteine PDZ avvengono realmente in vivo. Verranno effettuati esperimenti di co-immunoprecipitazione con lisati di cellule MDCK e/o con lisati di cervello di ratto che esprimono endogenamente le proteine PDZ identificate. Alternativamente dominanti negativi delle proteine PDZ, incapaci di legare il trasportatore, verranno espressi in cellule MDCK e in neuroni. L¿espressione del trasportatore sulla superficie cellulare verrà valutata tramite esperimenti di immunofluorescenza indiretta e biotinilazione. 2) verificare se le interazioni trasportatore-proteine PDZ siano modulate dall¿attivazione di vie di traduzione del segnale. E¿ noto in letteratura che la stimolazione di PKC tramite esteri del forbolo determina una rilocalizzazione di EAAC1 in compartimenti di endocitosi in epiteli. Poiché una serina e treonina sono contenute nel dominio di interazione con proteine PDZ di EAAC1, una possibilità è che la fosforilazione da parte di PKC di questi residui impedisca l¿interazione del trasportatore con le proteine PDZ, determinando l¿internalizzazione del trasportatore in compartimenti di endocitosi. Stimoleremo cellule MDCK esprimenti il trasportatore EAAC1 o mutagenizzato con TPA e valuteremo l¿espressione della proteina con esperimenti di immunofluorescenza, biotinilazione e tramite uptake di amino acidi marcati.