Messa a punto di un modello di cellule staminali ingenierizzate ad esprimere la ferritina e loro visualizzazione, mediante MRI, in modelli animali di ischemia

Razionale ed obiettivo. Le cellule staminali sono oggi considerate un potenziale terapeutico per il trattamento di patologie ischemiche. Studi recenti, che hanno valutato la sopravvivenza, la differenziazione e la migrazione di staminali trapiantate in tessuti animali non hanno, però, dati risultati soddisfacenti, in parte per la mancanza di una metodica adeguatemante sensibile e non invasiva che permetta la visualizzazione in vivo di tali cellule. Le tecniche di ¿immagine¿ della risonanza magnetica nucleare (MRI), di cui il nostro gruppo ha una lunga esperienza, sono in grado di fornire immagini con una elevata risoluzione spaziale nei piccoli animali, ma necessitano di un'adeguata marcatura delle cellule per la loro visualizzazione. Fra le varie strategie proposte, l¿incorporazione di nanoparticelle paramagnetiche di ferro ossido, visibile alle interrogazioni MRI, è stata ampiamente utilizzata. Il nostro gruppo, ha messo a punto sequenze MRI, mediante la tecnica delle immagini gradiente echo pesate in T2*, in grado di visualizzare cellule progenitrici endoteliali (EPCs), ottenute da sangue periferico di donatori sani e marcate con particelle paramagnetiche. Tale messa a punto è stata la premessa per lo sviluppo di una diversa strategia di ¿marcatura¿ delle cellule che prevede la trasduzione di EPCs con vettori virali esprimenti ferritina, proteina in grado di legare il ferro endogeno, un metallo con proprietà paramagnetiche ¿visibile¿ alle interrogazioni MRI. La possibilità di avere cellule che sovraesprimono ferritina, e quindi ferro intracellulare, permette di avere a disposizione un diverso strumento per la visualizzazione di cellule ¿naturalmente¿ paramagnetiche. Disegno dello studio. La ferritina, proteina deputata a legare di ferro endogeno intracellulare, è costituita da due catene amminoacidiche (leggera e pesante) in rapporti variabili in funzione del tessuto considerato. Si prevede pertanto di utilizzare vettori lentivirali contenenti un promotore costitutivo bidirezionale in grado di attivare l¿espressione genica di entrambe le catene della ferritina contemporaneamente. Questa strategia ci permette di poter introdurre entrambe le catene della ferritina all¿interno dello stesso vettore virale ed avere una produzione regolata delle due catene polipeptidiche, oppure inserire una sola delle due catene. Dopo aver valutato in vitro l¿espressione e la funzionalità del transgene in cellule EPCs trasdotte, le cellule sovraesprimenti ferritina verranno coltivate in terreno di coltura contenete un donatore di ferro e analizzate mediante MRI con la metodica messa a punto precedentemente. L¿obbiettivo successivo sarà quello di impiantare, in vivo, tali cellule in tessuti ischemici (cuore, cervello, muscolo) di diversi modelli animali al fine di visualizzare nel tessuto e seguire nel tempo la sopravvivenza, la differenziazione e la migrazione di tali cellule mediante sequenze MRI in funzione anche della via di impianto.