CORRELAZIONE GENOTIPO-FENOTIPO NELLA SINDROME DA MICRODELEZIONE NF1: RICERCA DI GENI CANDIDATI PER IL RITARDO MENTALE E LE MALFORMAZIONI CARDIACHE

La sindrome da microdelezione NF1 è dovuta alla mancanza di una copia del gene NF1 e geni fiancheggianti. Abbiamo evidenziato mediante studi di correlazione genotipo-fenotipo un¿incidenza significativamente superiore di ritardo mentale (RM) e anomalie cardiovascolari (AC) nei pazienti (pz) NF1 microdeleti, rispetto ai pz con NF1 classica. Questi studi hanno promosso la ricerca di geni della regione 17q11.2 implicati nell¿insorgenza del RM e delle AC. Nella regione mappano 4 geni espressi durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC) di cui due, CDK5R1 e OMG, sono stati sottoposti ad analisi mutazionale in pz con RM aspecifico che ha rivelato in entrambi i geni nuove mutazioni e nuovi polimorfismi, sia nella regione codificante che nelle regioni trascritte non tradotte (UTR). Data la particolare estensione del 3¿UTR di CDK5R1, è stato intrapreso uno studio funzionale finalizzato alla ricerca di elementi regolatori (ER) post-trascrizionali, potenziali bersagli di mutazioni patogenetiche. Esperimenti basati su saggi di Dual Luciferase di numerosi costrutti contenenti ER predetti e costrutti deleti degli stessi ER, hanno permesso di identificare motivi di sequenza che diminuiscono o aumentano l¿espressione del gene reporter. Per quanto riguarda la ricerca di geni implicati nello sviluppo del cuore abbiamo focalizzato l¿attenzione sui geni JJAZ1, CENTA2 e HCA66 che mappano nella regione NF1 deleta e sono risultati espressi sin dalle prime fasi di sviluppo. Studi successivi di ibridazione in situ (ISH) whole-mount su embrione di topo hanno evidenziato che CENTA2 è il gene espresso più precocemente nel cuore rispetto agli altri due, in particolare il gene si accende a 8.5 giorni di sviluppo embrionale che risulta essere il periodo che precede la formazione delle quattro camere cardiache. Obiettivi del progetto proposto sono quindi: 1) verificare l¿attività degli ER identificati mediante mutagenesi, cotrasfezione con oligonucleotidi antisenso; 2) verificare il legame degli ER identificati con fattori regolatori post-trascrizionali neuronali mediante saggi REMSA, UV cross-linking, immunoprecipitazione; 3) estendere lo screening mutazionale di CDK5R1, mediante DHPLC e sequenziamento automatico, a 400 pz con RM aspecifico, considerando, oltre alla regione codificante, il 3¿UTR in corrispondenza degli ER post-trascrizionali identificati; 4) studiare l¿espressione di Centa2 mediante ISH ed immunoistochimica su sezioni di cuore di embrioni di topo a diversi stadi di sviluppo; 5) estendere lo studio ISH a animali modello filogeneticamente più distanti quali zebrafish, per stabilire il grado di conservazione della funzione di CENTA2 durante l¿evoluzione e dedurre il ruolo di questo gene durante lo sviluppo del cuore. Il progetto oltre a contribuire all¿identificazione di nuovi geni e meccanismi implicati nello sviluppo del cuore e del SNC, fornirà utili evidenze per studi di correlazione genotipo-fenotipo nella sindrome da microdelezione NF1.