SVILUPPO E CARATTERIZZAZIONE DI UN ANTISIERO POLISPECIFICO ANTI-MITOCONDRIO PER STUDI DI PROTEOMICA SU OMOGENATI DI MUSCOLO IN TOTO
Progetto La rivelazione immunologica su un campione non purificato è un¿alternativa assai conveniente rispetto all¿applicazione di una procedura di colorazione generica su proteine purificate. Nella assoluta maggioranza dei casi l¿obbiettivo delle procedure immunologiche è la messa in evidenza di un singolo antigene impiegando un antisiero monospecifico; nondimeno, per alcune applicazioni possono essere utili degli antisieri polispecifici. Il nostro gruppo, con una ricerca finanziata negli scorsi anni anche da UNIMI (ref 8), ha iniziato lo studio del proteoma di mitocondri da muscolo umano. La mappa di riferimento è stata costruita impiegando mitocondri estratti da arti resecati chirurgicamente in pazienti traumatologici. Un¿analisi di campioni patologici (in casi di miopatia RR-MAD) è stata effettuata su casi rari in cui si sono effettuate sui pazienti delle macrobiopsie (10 grammi). Per ovviare a queste limitazioni ci proponiamo ora di sviluppare un antisiero diretto contro tutte le proteine mitocondriali che potrebbero essere messe in evidenza tramite immunoblotting dopo elettroforesi di omogenati da microbiopsie (10 mg). Attualmente si trovano in commercio un certo numero di antisieri diretti contro varie proteine e complessi di proteine, ma nemmeno nel loro insieme questi corrispondono alle esigenze di polispecificità inerenti all¿approccio che intendiamo seguire. Il fatto che in pazienti umani con malattie autoimmuni si riscontrino degli anticorpi anti-mitocondrio suggerisce che le proteine del mitocondrio umano possano costituire eteroantigeni fortemente immunogeni per il coniglio. Nello svolgimento di questo progetto immunizzeremo alcuni conigli maschi del ceppo New Zealand con mitocondri altamente purificati estratti da musclo umano, sonicati ed aggiunti di adiuvante. Condurremo l¿immunizzazione secondo protocolli standard e controlleremo nel tempo il titolo e la specificità degli anticorpi prodotti. Il tipico esperimento di controllo consisterà nel confrontare la pattern bidimensionale di mitocondri purificati e l¿immunoblotting di muscolo in toto. Gli antisieri dei diversi conigli verranno poi mescolati in modo opportuno e le immunoglobuline saranno purificate attraverso una procedura classica per salting-out con solfato d¿ammonio.