Ruolo di Sam68 nella regolazione dell¿espressione del recettore per la leptina in cellule muscolari scheletriche

Sam68 è una RNA-binding proteina che interviene sia nel metabolismo dell¿RNA che nelle vie trasduzionali. E¿ stato riportato che la leptina ingaggia Sam68, come molecola adattatrice, nella trasduzione del suo segnale. Abbiamo precedentemente indagato se l¿ormone fosse in grado di coinvolgere Sam68 anche nello splicing alternativo dell¿mRNA del suo stesso recettore. In cellule muscolari scheletriche di topo C2C12, responsive alla leptina, abbiamo valutato, in condizioni basali, l¿espressione di mRNA per le due principali isoforme recettoriali, ObRb, funzionalmente più competente, e ObRa, con competenze trasduzionali limitate, e abbiamo documentato che ambedue gli mRNA coimmunoprecipitano con Sam68. Abbiamo poi individuato che il trattamento acuto con leptina incrementa il legame di Sam68 all¿mRNA per il recettore lungo rispetto al legame della proteina con l¿mRNA per Ob-Ra. Abbiamo quindi proposto che la leptina tramite Sam68 possa regolare lo splicing alternativo dell¿mRNA del suo stesso recettore. OBIETTIVO Vogliamo ora indagare se Sam68 possa anche regolare il processo di traduzione dell¿mRNA per il recettore della leptina. METODI. In Cellule C2C12 controllo e trattate con l¿ormone, verrà indagato a) se il trattamento con leptina induce la traslocazione di Sam68 dal nucleo al citoplasma. A tale scopo verranno allestiti esperimenti di immunoprecipitazione di Sam68, seguiti da immunoblot, dalle due frazioni subcellulari; b) se il complesso Sam68-mRNA per ObRb è associato in condizioni basali alla frazione polisomiale (compartimento traduzionale) e se il trattamento con l¿ormone induce e/o incrementa tale associazione. A tale scopo verrà utilizzato un metodo per la separazione della frazione polisomiale riportato recentemente in letteratura (J. Biol. Chem. 278, 35145). In breve, fondelli arricchiti in frazioni polisomiali ottenuti da omogenati cellulari centrifugati a 10000xg saranno purificati mediante ultracentrifugazione su gradienti discontinui di saccarosio (19% su 27%). I polisomi sedimentati saranno opportunamente risospesi e utilizzati per immunoprecipitare Sam68. L¿RNA estratto dall¿mmunoprecipitato sarà poi analizzato mediante RT-PCR utilizzando primer specifici per le isoforme recettoriali della leptina. I prodotti amplificati saranno analizzati mediante Southern blot e ibridizzazione utilizzando sonde specifiche.