VALUTAZIONE DEL PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA IN MACROFAGI MURINI IN SEGUITO AD INFEZIONE CON CHLAMYDIA
Progetto I batteri del genere Chlamydia sono causa di infezioni sistemiche nell¿uomo e negli animali e presentano un rapporto con l¿immunità innata non ancora del tutto chiarito. Il presente progetto si prefigge di approfondire alcuni aspetti inerenti il rapporto ospite-parassita in un modello di infezione in vitro in macrofagi, applicando metodologie di analisi trascrizionale. In particolare, verrà effettuato, mediante RT-Real Time PCR, il monitoraggio di espressione di alcuni targets coinvolti nella risposta trascrizionale di cellule macrofagiche murine in seguito ad infezione con Chlamydia, preventivamente individuati mediante indagine con DNA microarrays effettuato a cura di un gruppo di ricerca della Facoltà di Medicina dell¿Università di Bologna nell¿ambito di un progetto in collaborazione cofinanziato dal MIUR. L¿integrazione fra le due tecniche per la validazione dell¿espressione differenziale dei geni target verrà assicurata effettuando la PCR Real Time con SYBR-Green: questo marker generico di amplificazione consente di determinare l¿espressione relativa di un numero relativamente alto di geni, compatibile con i risultati di una metodica di expression profiling di larga scala come i DNA microarrays. Per ogni gene candidato, l¿espressione differenziale, e l¿intensità di questa, verrà sottoposta a conferma mediante confronto fra i risultati delle due metodiche di screening. In pratica, sulla base delle informazioni ricavate dai microarrays, e delle sequenze disponibili in banca dati, verranno disegnati primers adatti per l¿amplificazione in Real Time con metodica SYBR-Green dei geni candidati, e/o verranno replicati protocolli di amplificazione specifica disponibili in letteratura. La quantificazione relativa verrà effettuata tramite confronto dell¿espressione dei targets nei diversi campioni, operata mediante calcolo del ¿¿Ct, dopo normalizzazione dei relativi cDNA con almeno due geni housekeeping, cioè geni la cui espressione nel tipo cellulare in questione sia risultata stabile ed indipendente dalle condizioni di stimolazione. La selezione di questi ultimi verrà effettuata sulla base delle evidenze di letteratura riguardanti il modello animale utilizzati per il progetto, sarà indirizzata dai risultati ottenuti mediante microarray e verrà confermata tramite verifica in RT- Real Time PCR della stabilità del livello di espressione nelle condizioni sperimentali. La validazione di espressione differenziale per un determinato gene potrà essere ottenuta quando il livello di espressione relativa risulti almeno pari ad un determinato fattore (per esempio, 2), rispetto al livello di espressione del controllo, concordemente per entrambe le metodiche. I risultati ottenuti a livello trascrizionale verranno inoltre confermati tramite verifica dell¿espressione a livello proteico dei target rilevanti mediante Western Blotting, ELISA e/o citometria a flusso in dipendenza dalla disponibilità in commercio dei relativi anticorpi specifici e kits.