DETERMINAZIONE DI INTERAZIONI STRUTTURALI E FUNZIONALI FONDAMENTALI PER L¿ATTIVITA¿ DEL COTRASPORTATORE DI AMINO ACIDI DI INSETTO, KAAT1.
Progetto KAAT1 è un cotrasportatore di amino acidi neutri, clonato dall¿intestino della larva di lepidottero Manduca sexta (Castagna et al., PNAS, 95: 5395-5400, 1998).
Sia KAAT1 che il suo paralogo CAATCH1, un altro trasportatore di amino acidi isolato da M. sexta, appartengono alla super famiglia dei trasportatori NSS o SLC6 che comprende, oltre a molti trasportatori di neurotrasmettitori, anche diversi trasportatori di amino acidi.
KAAT1 e CAATCH1 sono gli unici membri della famiglia in grado di effettuare processi di trasporto energizzati da gradienti elettrochimici di Na+, K+ ed, in misura minore, di Li+, di conseguenza essi rappresentano un ottimo strumento per l¿identificazione, attraverso l¿analisi comparata delle sequenze dei membri della famiglia, dei residui e delle interazioni fondamentali per l¿attività di trasporto di queste proteine.
Recentemente questo tipo di approccio ci ha permesso di determinare il ruolo svolto dal residuo Asp 338, localizzato nel VII dominio transmembrana di KAAT1, nella selettività ionica e nell¿accoppiamento del flusso dell¿amino acido e del catione che caratterizzano l¿attività di trasporto di KAAT1 (Mari et al.,CMLS, 61: 243-256, 2004).
Nel presente progetto intendiamo proseguire la nostra analisi alla ricerca di residui che interagendo con l¿Asp 338, possano concorrere a determinare la peculiare selettività ionica di KAAT1.
Alcuni dati preliminari indicano che la Lys 102 possa essere uno di tali residui. Questo residuo è specifico di KAAT1 e CAATCH1 ed è localizzato nel II dominio transmembrana.
Abbiamo prodotto alcuni mutanti di questi residui che sono stati analizzati mediante espressione in oociti di Xenopus laevis e misurazione di flussi di amino acidi marcati, ed è stato possibile mettere in evidenza un¿ interazione di tipo funzionale tra Lys 102 e Asp 338. La nostra analisi intende a questo punto caratterizzare dal punto di vista cinetico questi mutanti e stabilire se l¿interazione tra i due residui sia anche strutturale. Questa ipotesi è confortata anche dal fatto che nella struttura cristallina ottenuta recentemente per un membro batterico della famiglia NSS, il trasportatore LeuTAa (Yamashita et al., Nature 437: 215-223, 2005), è possibile mettere in evidenza la prossimità dei domini transmembrana II e VII.
Al fine di stabilire il significato di questa interazione nell¿ambito della famiglia dei trasportatori NSS, prenderemo in considerazione anche un altro membro della famiglia, il trasportatore batterico di triptofano TnaT (Androutsellis-Theotokis A., J Biol Chem 278: 12703-12709, 2003). L¿analisi preliminare di mutanti corrispondenti a quelli di KAAT1 ha infatti messo in evidenza un comportamento analogo a quello di KAAT1. L¿analisi dei mutanti di TnaT verrà effettuata in collaborazione con il Prof. Gary Rudnick della Yale University, Connecticut, USA