RUOLO DELLA PROTEINA CENTROSOMALE MARK4 NEI GLIOMI: UP-REGOLAZIONE E INSTABILITA' CROMOSOMICA
Progetto MARK4 (microtubule-affinity regulating kinase 4) è un componente di una famiglia di serin-treoninchinasi che nei mammiferi influenzano la dinamica dei microtubuli fosforilando le proteine associate (MAP). L¿itinerario di ricerca che ci ha portato ad interessarci di MARK4 ha preso avvio dalla caratterizzazione citogenetico-molecolare (mediante FISH) di riarrangiamenti della regione cromosomica 19q13 determinanti duplicazione di questo gene in linee di glioma (Beghini et al, 2003) e dalla successiva conferma con array-CGH (Ibridazione Genomica Comparativa su array) in un piu¿ ampio pannello di linee di glioma che MARK4 mappa in una regione di ¿gain¿, al di fuori dell¿area di perdita di eterozigosi (LOH) dei gliomi (Magnani et al., 2005; Roversi et al., 2006). La dimostrazione che l¿isoforma L di MARK4 è espressa in progenitori neurali umani ed è upregolata nei gliomi ed evidenze della letteratura sulla localizzazione centrosomale di costrutti di MARK4 in cellule recipienti, ha costituito il razionale del presente progetto finalizzato a stabilire il ruolo di MARK4 nei processi mitotici abnormi di tumori come i gliomi, caratterizzati da spiccata instabilità cromosomica. Utilizzando anticorpi per la gamma tubulina e la pericentrina abbiamo dimostrato nelle linee di glioblastoma caratterizzate con a-CGH una correlazione tra percentuale di cellule con centrosomi soprannumerari ed aneuploidie. Mediante immunofluorescenza con anticorpi per MARK4 abbiamo rilevato colocalizzazione di MARK4 nel centrosoma in tutte le fasi del ciclo cellulare, nel nucleolo e nel midbody. Al fine di confermare tali localizzazioni ci proponiamo di ibridare con anticorpi specifici Western blot da lisati proteici di frazioni centrosomali, nucleolari e di midbody di linee di gliomi. Intendiamo poi mediante immunoprecipitazione e Western blot con anticorpi specifici per interattori noti di MARK4 quali la chinasi LKB1 e proteine della famiglia 14-3-3, esplorare gli effetti di questa cascata di signalling sui riarrangiamenti del citoscheletro in linee di gliomi, progenitori neurali normali e astrociti . Interattori nuovi di MARK4 verranno invece cercati con analisi in spettrometria di massa delle proteine MARK4-associate. Per stabilire i meccanismi che regolano l¿espressione temporale di MARK4, i trascritti e le isoforme proteiche di precursori neurali, astrociti e linee di gliomi a cariotipo quasi-diploide ed aneuploide sincronizzati e sortati al FACS, verranno analizzati in real time PCR e immunoblot. Linee di glioblastoma overesprimenti MARK4 verranno selezionate per esperimenti di silenziamento con siRNA su cellule sincronizzate. Viceversa astrociti umani e linee di gliomi senza anomalie del cariotipo e centrosomi aberranti verranno trasfettate con costrutti contenenti l¿intero MARK4cDNA. Le cellule trasfettate con MARK4 silenziato od overespresso verranno sottoposte ad un test in vitro per i micronuclei per valutare l¿entità dell¿instabità genomica.