Ruolo delle sequenze ripetute LINEs nel legame dell¿RNA di XIST all¿eterocromatina del cromosoma X inattivo

RAZIONALE: Dati recenti della letteratura indicano che il cromosoma X inattivo (Xi) presenta differenti tipi di eterocromatina facoltativa ben delimitati spazialmente lungo il cromosoma. Principalmente si possono distinguere regioni ricche in macro istone H2A (mH2A) e in metilazione della lisina 27 dell¿istone H3 (H3TrimK27) alternate a regioni ricche in metilazione della lisina 9 dell¿istone H3 (H3TrimK9) e metilazione della lisina 20 dell¿istone H4 (H4TrimK20). Al primo tipo di eterocromatina si lega l¿RNA di XIST, mentre al secondo tipo si lega HP1, una proteina tipica delle regioni eterocromatiche. In immunofluorescenza su nuclei interfasici infatti, il dominio nucleare dell¿Xi risulta nettamente diviso in due regioni eterocromatiche adiacenti, una positiva a mH2A, H3TrimK27 e XIST (tipo1), e l¿altra positiva a H3TrimK9, H4TrimK20 e HP1 (tipo2). Un interrogativo a cui si sta cercando ancora di rispondere è come l¿RNA di XIST si leghi alle regioni eterocromatiche. Il completo sequenziamento del cromosoma X, ci ha permesso di evidenziare che esso è particolarmente ricco in sequenze ripetute rispetto agli autosomi, in particola di ¿long interspersed nuclear elements¿ (LINEs). Un¿ipotesi recente, vedrebbe queste sequenze come possibili ¿elementi di ancoraggio¿ per il legame tra XIST e il cromosoma Xi, anche perché si è trovata una elevata concentrazione di LINEs in regioni ricche di geni soggetti all¿inattivazione, mentre nelle regioni ricche di geni che sfuggono all¿inattivazione queste sequenze risultano meno frequenti. Per verificare questa ipotesi ci proponiamo di analizzare il contenuto di LINEs nei due tipi di eterocromatina di cui è risultato costituito il cromosoma Xi. Se queste sequenze hanno un ruolo nel legame tra XIST e il cromosoma X, ci aspettiamo di trovare un arricchimento di LINEs nelle regioni di tipo 1, dove è presente l¿RNA di XIST, rispetto alle regioni di tipo 2, dove invece si lega HP1. METODI: Verranno utilizzate due linee cellulari di ibrido uomo-roditore che hanno mantenuto come unico cromosoma umano l¿X attivo (Xa) (Y.162.11C) o l¿X inattivo (Y.162.5E1T2). Le due tipologie di eterocromatina verranno isolate mediante immunoprecipitazione della cromatina con anticorpi diretti contro: -H3TrimK27 e mH2A per il tipo 1; -H3TrimK9 e H4TrimK20 per il tipo 2. La determinazione quantitativa delle LINEs nelle varie frazioni di immunoprecipitato sarà effettuata con real-time PCR con primers che mappano nella regione 5¿ delle LINEs, questi primers permettono di valutare il contenuto globale di queste sequenze ripetute. La valutazione quantitativa ci permetterà di stabilire se, nell¿ibrido Y.162.5E1T2 con solo l¿Xi, è presente un arricchimento delle LINEs nelle frazioni ottenute con gli anticorpi contro H3TrimK27 e mH2A, rispetto a quelle ottenute con gli altri anticorpi. L¿ibrido Y.162.11C, che mantiene l¿Xa, verrà utilizzato come controllo negativo; sull¿Xa infatti non sono presenti le modificazioni in studio.