Valutazione dell' efficacia e del meccanismo molecolare del nitrossido come agente terapeutico nelle distrofie muscolari
Progetto Il nitrossido (NO) svolge un ruolo importante nella fisiologia del muscolo scheletrico, di cui regola l'attività contrattile ed il bilancio energetico, promuove la mitocondriogenesi, protegge le miocellule dalla morte per apoptosi e favorisce la miogenesi. Nella distrofia muscolare di Duchenne, malattia per la quale non vi è terapia risolutiva, parte del danno origina da una ridotta funzione della NO sintasi muscolare dovuta alla sua localizzazione ectopica per mancanza di un complesso distrofina-sarcoglicano corretto e funzionale. Ci siamo proposti di valutare un possibile ruolo terapeutico di NO e nel corso del precedente progetto FIRST abbiamo dimostrato che l'utilizzo di un composto, HCT1026 (nitroflurbiprofene) che combina proprietà antiinfiammatorie non steroidee con rilascio di NO ha forte e persistente efficacia terapeutica. Abbiamo inoltre evidenza che la regolazione della attività mitocondriale da parte di NO spieghi almeno in parte il suo effetto terapeutico.
OBIETTIVO - valutare le basi molecolari della azione terapeutica nella distrofia muscolare dei composti rilascianti NO con attività antiinfiammatoria.
DESCRIZIONE - i) valuteremo la capacità dei composti rilascianti NO con attività antiinfiammatoria nitroparacetamolo e nitroibuprofene e della combinazione isosorbide dinitrato con ibuprofene di promuovere il differenziamento di cellule satelliti e di stimolarne la fusione a mitoubi distrofici. Utilizzeremo colture primarie di cellule satelliti di topo, capaci di rigenerare muscolo scheletrico. Misureremo dopo esposizione a NO in vitro l'indice di fusione, markers biochimici del differenziamento, espressione di geni per microarray, funzionalità mitocondriale inclusa la capacità di fusione/fissione, il bilancio energetico muscolare e la resistenza al danno citotossico. Tratteremo topi knockout per alfa-sarcoglicano, un valido modello sperimentale di distrofia, con diete contenenti i suddetti composti farmacologici ed analizzeremo la loro efficacia terapeutica analizzando dopo trattamento l'aspetto istologico e lo stato funzionale del muscolo mediante immunoistochimica con marcanti appropriati, combinata con saggi di funzionalità in muscoli isolati. Si misurerà anche il recupero di funzionalità muscolare in vivo (attività creatin chinasica serica e saggi di resistenza allo sforzo). Valuteremo in parallelo il meccanismo della efficacia terapeutica dei composti rilascianti NO, o della combinazione isosrbide dinitrato/ibuprofene. In particolare valuteremo ex vivo in fettine di muscolo isolate da animali trattati la funzionalità mitocondriale, il bilancio energetico muscolare, il rapporto tra mitocondri fusi e fissi e la resistenza al danno citotossico. La comparazione dei dati ottenuti negli esperimenti ex vivo ed in vitro con il dato terapeutico in vivo ci permetterà di determinare:
1) quale tra i trattamenti farmacologici in esame abbia maggiore efficacia terapeutica;
2) il meccanismo sottostante la loro azione terapeutica