ANALISI DELL¿INTERATTOMA DELLA RODANESI (RHDA) DI AZOTOBACTER VINELANDII COME STRUMENTO PER CONOSCERE IL RUOLO FUNZIONALE DELLE PROTEINE ¿RHODANESE-LIKE¿
Progetto Lo studio dell¿interattoma specifico di una proteina può fornire importanti informazioni sul suo coinvolgimento in determinati processi cellulari. In questa proposta, la ¿Tandem-Affinity Purification¿ (TAP)(1) è il sistema ¿pull down¿ che si intende sviluppare per isolare l¿interattoma della rodanesi (RhdA) di Azotobacter vinelandii. Diverse evidenze sperimentali del nostro laboratorio (2, 3), ottenute anche dalle ricerche condotte nell¿ambito del precedente FIRST (2006), suggeriscono che la funzione di RhdA dipenda dall¿interazione con proteine specifiche (i.e.: IscS). L¿identificazione delle proteine interagenti con RhdA, mediante un approccio di proteomica combinata con la TAP, usufruendo delle annotazioni in corso sulla sequenza completata del genoma di A. vinelandii, dovrebbe portare a delucidare molti aspetti funzionali di RhdA, il cui significato può essere esteso a tutta la numerosa superfamiglia di omologia delle proteine ¿rhodanese-like¿.
Per lo sviluppo di questo approccio è necessario predisporre, in A. vinelandii, un sistema per l¿espressione (in condizioni sub-native) della proteina ¿bait¿ (RhdA) munita di un ¿tag¿ multiplo, contenente i domini di legame riconosciuti durante la TAP dell¿interattoma. Il seguente progetto sarà quindi articolato nelle seguenti fasi: analisi in silico della regione genomica contenente il gene rhdA per la caratterizzazione delle unità trascrizionali; analisi della struttura 3D di RhdA per l¿individuazione dei siti di inserzione del TAP-¿tag¿; progettazione e preparazione di costrutti idonei per un espressione controllata (TAP-¿tagging¿ plasmidico) o per un ¿gene replacement¿ (TAP-¿tagging¿ genomico) di rhdA in A. vinelandii, e in cui la sequenza codificante il TAP-¿tag¿ è fusa a diverse posizioni selezionate di rhdA; trasformazione e ottenimento di ceppi di A. vinelandii esprimenti RhdA TAP-¿tagged¿; analisi di espressione e caratterizzazione delle varianti TAP-¿tagged¿ di RhdA mediante anticorpi anti-RhdA e saggi di attività solfotransferasica.
1. Puig et al. (2001) METHODS 24, 218
2. Cereda et al. (2003) Biol. Chem. 384, 1473
3. Forlani et al. (2005) FEBS Lett. 579, 6786