EDF-1 è coattivatore trascrizionale di PPAR¿, cruciale nel differenziamento adipocitario. Si propone di studiare la funzione di EDF-1 nell¿adipogenesi. Si utilizzerà un modello in vitro di differenziamento adipocitario (3T3-L1) e un modello in vivo (zebrafish).
In vitro
1. Espressione di EDF-1 nel differenziamento adipocitario.
Abbiamo dimostrato un¿azione concertata EDF-1/ PPAR¿ nel differenziamento delle 3T3-L1 in adipociti. Per comprendere il ruolo di EDF-1, se ne inibirà l¿espressione con siRNA. 3T3-L1 trasfettate con siRNA saranno indotte a differenziare per stimolo con insulina, isobutilmetilxantina e desametazone. Dopo 6 giorni, si quantificherà l¿accumulo di lipidi con Oil Red.
2. Analisi dell¿attivazione trascrizionale mediata da EDF-1 e PPAR¿.
Ci proponiamo di comprendere se EDF-1 è implicato nell¿attivazione di promotori PPAR¿ dipendenti: trasfetteremo 3T3-L1 con un plasmide contenente la luciferasi come gene reporter sotto il controllo di un promotore artificiale ottenuto per fusione di 4 sequenze consensus per PPAR¿. Indurremo quindi il differenziamento come descritto sopra e analizzeremo l¿attivazione trascrizionale PPAR¿ dipendente a diversi tempi dall¿inizio del differenziamento, misurando l¿attività luciferasica.
3. Analisi del profilo di espressione genica in cellule 3T3-L1 che non esprimono EDF-1.
Ci proponiamo di identificare i geni attivati in modo EDF-1 dipendente nel corso del differenziamento adipocitario mediante microarray su 3T3-L1 controllo vs quelle stabilmente trasfettate con siRNA anti-EDF-1. I geni differenzialmente espressi saranno analizzati mediante Real-Time-PCR. L¿identificazione di geni modulati da EDF-1 ci darà informazioni circa la specificità di questo coattivatore trascrizionale.
In vivo
Zebrafish è un modello sperimentale utile per lo studio del metabolismo lipidico. Grazie allo sviluppo rapido e alla sua trasparenza ottica, usare zebrafish come modello sperimentale semplifica lo studio di fenomeni biologici. Abbiamo clonato PPAR¿ e EDF-1 in zebrafish, primo step per gli studi che proponiamo:
1. Knock-down (KO) zebrafish per PPARgamma ed EDF-1 mediante l¿utilizzo di morfolini.
I morfolini (MO) sono analoghi antisenso del DNA per sostituzione dell¿anello di pentoso che inibiscono la traduzione del gene bersaglio. Ci proponiamo di utilizzare i MO per ottenere zebrafish KO per PPAR¿ e EDF-1 e studiarne gli effetti sull¿accumulo lipidico.
2. Analisi dell¿accumulo lipidico on zebrafish KO per PPAR¿ e EDF-1.
Aggiungeremo all¿acqua specifici pigmenti vitali, tra cui fosfolipidi fluorescenti, che saranno ingeriti da zebrafish, sottoposti all¿azione delle lipasi endogene e rapidamente trasportati alla vescicola biliare. Dato che i) PPAR¿ ha un ruolo nell¿adipogenesi e nell¿accumulo di grassi in vivo, e ii) EDF-1 è un coattivatore trascrizionale di PPAR¿, utilizzeremo fosfolipidi fluorescenti per valutarne l¿accumulo nella vescicola biliare di zebrafish KO per EDF-1 e/o PPAR¿.