Obiettivo generale della ricerca: Studio del metabolismo della vitamina D3 in colture cellulari di Solanum malacoxylon. Da colture cellulari ottenute da foglie di Solanum malacoxylon sono stati estratti e identificati: 7-deidrocolesterolo (in calli cresciuti al buio), colesterolo, vitamina D3 e i suoi metaboliti idrossilati 25(OH)D3 e 1¿,25(OH)2D3. La via metabolica di biosintesi del calcitriolo è quindi presente nelle piante e sembra seguire lo stesso percorso identificato negli animali: 7-deidrocolesterolo (reazione fotochimica) ¿vitamina D3 ¿ 25(OH)D3 ¿1¿,25(OH)2D3 (o calcitriolo, ormone importante nella regolazione dell¿omeostasi calcio-fosfato nei mammiferi e utilizzato nella cura di diverse patologie). Lo studio biochimico della biosintesi della vitamina D nelle piante può portare informazioni utili per lo sviluppo di progetti di ingegneria metabolica miranti a migliorare, in colture vegetali, la produzione di calcitriolo.
Obiettivo specifico: utilizzo di inibitori della via biosintetica degli steroli per incrementare la sintesi di calcitriolo in colture cellulari di Solanum malacoxylon. Il 7-deidrocolesterolo è precursore sia della vitamina D3 che del colesterolo. Per cercare di incrementare la sintesi di calcitriolo stiamo utilizzando B 15766, inibitore competitivo dell¿enzima 7-deidrocolesterolo riduttasi che catalizza la riduzione di 7-deidrocolesterolo in colesterolo. L¿effetto di questo derivato della piperazina è già stato investigato in vivo, in diverse specie animali, e in colture cellulari di epatociti di ratto evidenziando una riduzione della sintesi del colesterolo e un contemporaneo aumento di 7-deidrocolesterolo dose dipendente (J. Aufenanger et al. Biochem. Farm. 1986). E¿ già stato svolto nell¿anno in corso un lavoro preliminare di messa a punto delle condizioni di crescita delle colture, estrazione dei metaboliti, separazione ed analisi degli steroli in gas-cromatografia e dei metaboliti della vitamina D in LC/MS/MS, in un sistema con sorgente APCI. Attualmente stiamo valutando l¿effetto dell¿inibitore sulla crescita delle colture.
Risultati attesi - Trattando le colture cellulari di Solanum malacoxylon con B 15766 ci aspettiamo di ottenere un maggiore accumulo cellulare di 7-deidrocolesterolo e quindi, dopo esposizione delle colture alla luce, un maggior flusso di metaboliti nella via metabolica della vitamina D3.
Il B15766 verrà testato anche insieme a un inibitore di enzimi SMT (S-adenosilmetionina transferasi ). Lo sterolo maggiormente presente nella membrane cellulari delle piante è infatti il ß-sitosterolo che si forma dal cicloartenolo in seguito a due successive metilazioni in C-24. Il cicloartenolo è precursore anche della via metabolica che porta a 7-deidrocolesterolo e colesterolo. Bloccando la metilazione del cicloartenolo e contemporaneamente la riduzione del 7-deidrocolesterolo a colesterolo ci aspettiamo un ulteriore incremento del flusso di metaboliti indirizzato verso la sintesi di calcitriolo.