Struttura quaternaria della glutammato sintasi: definizione, dipendenza da ligandi e influenza sulle attivita¿ catalitiche dell¿ enzima.
Progetto La glutammato sintasi (GltS) è un ferro-zolfo flavoenzima complesso che forma con la glutammina sintetasi la via principale di assimilazione dell¿ ammonio in microorganismi, piante e animali inferiori, tra cui patogeni ( e.g.: M. tuberculosis, Plasmodium falciparum) o loro vettori (e.g.: Anopheles). Gli studi compiuti sulle GltS batterica NADPH-dipendente (NADPH-GltS) e di cianobatterio ferredossina-dipendente (Fd-GltS) hanno permesso di definire un modello minimo della reazione di sintesi riduttiva del glutammato (L-Glu) da glutammina (L-Gln) e 2-ossoglutarato (2-OG) e messo in luce come l¿ enzima è soggetto ad un meccanismo di controllo e attivazione delle reazioni parziali che avvengono ai 3 siti catalitici in modo che solo quando l¿enzima è nel corretto stato redox e in complesso con il 2-OG, viene resa possibile l¿idrolisi della L-Gln (al sito glutaminasico nella subunità a, aGltS, ~150 kDa) e avviene il trasferimento della molecola di ammoniaca rilasciata, attraverso un tunnel intramolecolare, al sito sintasico (nella aGltS ) dove avviene l¿addizione dell¿ammoniaca al 2-OG e la successiva sintesi riduttiva di L-Glu. La struttura della aGltS e della Fd-GltS (costituita da un¿unica catena polipeptidica simile alla aGltS) sono state risolte. Non è stato però ancora possibile ottenere cristalli dell¿unità cataliticamente attiva costituita dall¿associazione stabile delle subunità a e b (~50 kDa) della NADPH-GltS, lasciando indefiniti la posizione e il ruolo dei centri ferro-zolfo dell¿enzima e gli ipotizzati cambiamenti conformazionali indotti nella subunità a a seguito dell¿associazione con la subunità b. Pertanto, sono stati intrapresi esperimenti di microscopia elettronica a bassa temperatura (cryoEM), scattering di raggi X a basso angolo (SAXS), e microscopia a forza atomica (AFM) per ottenere modelli, sebbene a bassa risoluzione, dell¿oloenzima. Gli esperimenti condotti sin qui hanno dimostrato come in soluzione la GltS esiste come protomero ab (214 kDa) in equilibrio con forme di aggregazione superiori fino a formare esameri (ab)6. La dissociazione dell¿esamero è indotta a bassa concentrazione proteica e alta forza ionica, in un processo lento, la cui reversibilità è in corso di verifica. Dati preliminari indicano anche che il NADP+, prodotto di reazione, promuove la dissociazione dell¿esamero, suggerendo un potenziale nuovo meccanismo di regolazione della GltS. Intendiamo ora determinare: (1) l¿effetto del NADP+ (o suoi derivati) sullo stato di aggregazione con esperimenti di dynamic light scattering e gel filtrazione analitica che saranno complementati da esperimenti SAXS, cryoEM e AFM; (2) i parametri cinetici della reazione in funzione della concentrazione della GltS mediante cinetica rapida, e (3) verificare il modello dell¿esamero della NADPH-GltS costruito in base ai dati di cryoEM mediante la costruzione e caratterizzazione di mutanti sito-diretti dell¿enzima.