Valutazione dell'efficacia di un nuovo anticorpo anti C5 ad alta affinità endoteliale nella protezione del danno da ischemia riperfusione in un modello sperimentale di trapianto renale nel suino
Progetto Nella patogenesi del danno da ischemia/riperfusione che si manifesta dopo l¿impianto dell¿organo prelevato il sistema del complemento svolge un ruolo chiave. Lo studio si propone di utilizzare un nuovo anticorpo murino ottenuto da una phage display library di leucociti umani, diretto contro il componente C5 del complemento che inibisce il taglio proteolitico della molecola C5 nei due frammenti C5a e C5b. Tale anticorpo (single chain fragment variable) viene quindi addizionato di catena fissa ottenuta dalle IgG suine e di un segmento (RGB) che ne aumenta l¿affinità per le cellule endoteliali (ScFv anti C5 minibody-RGB). L¿anticorpo Anti-C5 è stato caratterizzato tramite studi funzionali in vitro che ne hanno evidenziato la capacità di legare specificatamente la molecola C5 ed inibire l¿attivazione del complemento. Recentemente, il proponente in un modello murino, ha dimostrato che l¿iniezione endovenosa dell¿anticorpo anti-C5 mezz¿ora prima della rivascolarizzazione del cuore da trapiantare, è capace di inibire l¿attivazione del complemento e limitare il danno ischemico nell¿organo trapiantato. Lo studio proposto valuterà l¿impiego di (anti-C5 minibody RGD) in un modello di allotrapianto renale nel maiale. Lo studio verrà suddiviso in due fasi allo scopo di valutare l¿efficacia del farmaco e il modo di somministrazione proposto.
Modello sperimentale : In una prima fase verranno utilizzati dei maiali (White Largebreed) del peso di 30-40 kg. Entrambi i reni verranno prelevati e perfusi ex vivo con dosi crescenti di soluzione di antiC5-RGD e mantenuti in ipotermia a 4°C per 4, 8, 12, 24 ore. Su questi reni verranno quindi eseguiti studi immunoistochimici per valutare il grado di saturazione endoteliale da parte dell¿anticorpo e la sua persistenza nel tempo fino a trovare la concentrazione teoricamente più efficace. In una seconda fase, si procederà al modello di autotrapianto. Nel maiale, in anestesia generale si procederà al prelievo del rene sinistro, che verrà perfuso al banco con la soluzione di antiC5-RGD e mantenuto in soluzione di Celsior a 4°C per 24 ore. Successivamente verrà eseguito l¿autotrapianto del rene sullo stesso maiale e si procederà contestualmente alla nefrectomia del rene destro. Verranno eseguiti i seguenti studi : Studi istologici : valutazione dell¿apoptosi tubulare (TUNEL e DNA laddering,) su reni 1, 24 ore, 3 e 7 giorni dopo il declampaggio. Valutazione istologica del danno tubulare (metodo semiquantitativo) su campioni di tessuto ottenuti durante gli stessi periodi. Valutazione ultrastrutturale del danno endoteliale mediante microscopia elettronica. Studio funzionale Determinazione di Creatininemia, Azotemia, Ionemia, Clearance della Creatina, Ionuria, Proteinuria, Enzimuria (GGT, ALP) in 2° e 7° giornata postoperatoria
Studio molecolare : espressione di molecole di adesione (ELAM, ICAM, VCAM), citochine pro-infiammatorie (IL-1, IL-6, TNF), geni pro-e anti-apototici (BAX e Bcl2) mediante Real Time PCR.